基于可編程邏輯控制器的超聲陣列輔助酶解控制系統設計與試驗

丁艷華 馬海樂 曲文娟 肖 鳳

(1. 江蘇大學機械工程學院，江蘇 鎮江 212013；2. 江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013)

近年來，國內外研究學者[1-4]將超聲技術應用于生物酶解，通過超聲空化效應增強酶解底物與酶的接觸，使酶解效果得到了明顯改善。超聲作用時采用的頻率模式和作用時間是影響其效果的重要參數。已有學者[5-7]指出，當給定超聲頻率接近反應系統的共振頻率時，輸出的化學產額接近最大，因此采用多頻模式更容易找到與處理系統匹配的諧振頻率，產生較好的超聲處理效果。然而，目前有關超聲輔助酶解的報道[8-9]中使用最多的是單頻和雙頻，三頻及以上的復合頻率使用較少，因此，超聲在酶解中的應用受到限制。

另外，目前大多超聲輔助酶解系統多為手動操作，酶解產物的理化特性、生物活性等指標需要離線測定化學值進行判斷，需要多次采樣測定，耗時、耗力，而且酶解終點無法及時判斷，易造成酶解不足或過度酶解。基于以上問題，試驗擬設計S型五頻超聲陣列的多頻多模式頻率控制，并將近紅外光譜原位實時監測與可編程邏輯控制器(Programmable logic controller，PLC)控制技術相結合，以期實現酶解終點的自動控制。

1 系統結構及方案設計

1.1 整體結構

以PLC為主控制器的S型五頻超聲陣列輔助酶解系統的結構如圖1所示。

系統的工作過程：將需要酶解的料液置于酶解槽內，選擇超聲模式，再加入反應酶并啟動超聲設備開始酶解。酶解過程中將光譜數據發送到上位機，利用Matlab軟件建立預測模型，將模型計算得到的血管緊張素轉換酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)抑制率預測值進行迭代計算，若達到目標值，利用PC ACCESS改寫對應的變量存儲器狀態，終止酶解，進行后續的滅酶工作。

1. 上位機(計算機) 2. PLC 3. 觸摸屏 4. 近紅外光譜儀 5. 20 kHz超聲電源 6. 28 kHz超聲電源 7. 35 kHz超聲電源 8. 40 kHz超聲電源 9. 50 kHz超聲電源 10. 20 kHz超聲反應腔 11. 28 kHz超聲反應腔 12. 35 kHz超聲反應腔 13. 40 kHz超聲反應腔 14. 50 kHz超聲反應腔 15. 橡膠管 16. 燒杯 17. 水浴鍋 18. 蠕動泵圖1 S型五頻超聲陣列輔助酶解系統結構圖Figure 1 Structure of S-type five-frequency ultrasound-array-assisted enzymatic hydrolysis system

1.2 硬件配置

1.2.1 控制器配置 系統的主控制器采用西門子公司生產的S7-200 PLC。該款控制器性能穩定，抗干擾能力強，編程方便、指令豐富、可實現多種先進控制算法[10-11]，主要包括CPU、存儲器、輸入輸出接口、電源和通信模塊。PLC配置如表1所列。

1.2.2 人機交互裝置 人機界面采用西門子Smart 700觸摸屏。模塊采用高端的ARM處理器，數據處理速度快，畫面切換流暢。與上位機通過PC/PPI連接進行通信，組態好、項目傳送完畢后通過RS485端口連接到S7-200 PLC編程口建立二者通信。

表1 S7-200 PLC配置

1.2.3 S型五頻超聲陣列 S型五頻超聲陣列共有20，28，35，40，50 kHz 5種頻率。頻率可設定為單頻、雙頻和三頻。設計的頻率組合如表2所示。組合頻率(雙頻和三頻)可為同步或順序兩種工作模式。同步模式為2種或3種頻率超聲同時工作，順序模式為2種或3種頻率超聲依次按照順序工作。

表2 五頻超聲陣列頻率模式?

超聲結構為腔式，超聲換能器直接作用于反應腔。將開始酶解的料液通過蠕動泵送入超聲腔，從超聲腔的下管進上管出，自下而上的循環使超聲處理更均勻。使用多種頻率組合時，將不同超聲反應腔上的物料管依次串聯相接，類似S型。每臺超聲波發生器均設有遠程控制端口，因此PLC可對發生器電源內部嵌入式芯片發送高、低電平，由此決定超聲波換能器是否發出超聲波。

1.2.4 近紅外光譜采集 近紅外光譜所反應的主要是含氫基團的信息，因此在分子的結構識別尤其是蛋白質結構的定性及定量分析中具有較強的技術優勢[12-13]。選用美國海洋光學(上海)有限公司的NIRQUEST型近紅外光譜儀，采用對近紅外光靈敏度比較高的InGaAs檢測器，波長范圍900～2 500 nm，如圖2所示。

1.3 超聲陣列控制系統設計

1.3.1 超聲工作模式控制流程 根據表2所列的超聲陣列頻率模式，設計PLC控制系統。地址分配表見表3。順序流程圖見圖3。系統通電后，首先上電初始化。再通過觸摸屏中模式選擇變量指定一種頻率模式，進入選擇性分支。第一分支為單頻模式，選定一種頻率，設置超聲時間和間歇時間(單位為s)，間歇時間是超聲工作和停止的比例，最后啟動超聲。第二和第三分支對應雙頻和三頻模式。雙頻和三頻的順序模式下需要設置不同頻率工作的具體時間，稱為交替時間。

1. 恒溫水浴鍋 2. 電動攪拌器 3. 水浴燒杯 4. 光纖 5. 鐵架 6. 光源 7. 近紅外光譜儀圖2 近紅外光譜采集裝置Figure 2 Near-infrared spectroscopy acquisition device

表3 PLC的變量地址分配

圖3 超聲陣列模式控制流程圖Figure 3 Flow chart of ultrasound-array mode control

1.3.2 人機界面設計 根據超聲模式控制流程設計終端控制人機界面。觸摸屏組態軟件為Wincc flexible。該設計共組態了4個畫面，分別為模式選擇主界面、單頻、雙頻和三頻模式。其中主界面如圖4所示。

1.4 酶解過程光譜采集

將采集的光譜建立數學模型對化學值進行預測，建模時首先要建立校正模型和預測模型。酶解樣品中共采集90個光譜，采集光譜的同時采樣，離線測定化學值。

圖4 觸摸屏主界面Figure 4 Home interface of touch screen

采用化學計量學方法，在數學與建模專業軟件Matlab中完成近紅外光譜原位監測。

2 酶解試驗驗證

2.1 材料、試劑與儀器

大米蛋白：總蛋白含量79%，西安金碩果業有限公司；

堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 LFG)：酶活2×105U/mL，諾維信(南京)生物技術有限公司；

血管緊張素轉換酶(ACE)：實驗室自制；

馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippury1-His-Leu，HHL)：美國Sigma公司；

可編程控制器：S7-200型，上海控鴻自動化設備有限公司；

超聲陣列：S型，課題組自主研制；

電動攪拌器：JJ-1型，江蘇金壇市中大儀器廠；

離心機：LD5-2A型，北京醫用離心機廠；

近紅外光譜儀：NIRQUEST型，美國海洋光學(上海)有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 酶解方法 據課題組已有研究成果，低頻超聲相對高頻對大米蛋白輔助酶解處理效果更好[14]，因此選擇單頻28 kHz連續模式；順序雙頻20 kHz/28 kHz，2種頻率的超聲時間各6 s和順序三頻20 kHz/28 kHz/35 kHz，3種頻率的超聲時間各4 s。

用燒杯配置濃度為40 g/L的大米蛋白懸浮液(溶解介質為3 mmol/L的稀堿溶液)1 500 mL。將大米蛋白懸浮液在50 ℃的水浴中攪拌平衡10 min，用1 mol/L的NaOH將pH值調節到8.5，立即加入堿性蛋白酶，加酶量2.4 mL/L。開始酶解后將懸浮液通過蠕動泵在超聲腔中循環。每個超聲波發生器的額定功率為300 W，酶解時長為90 min，酶解過程中每間隔3 min采集一次樣品，3種模式共采集樣品90個。將采集的樣品離心后取上清液，冷藏備用。

2.2.2 光譜采集方法 將光譜儀插入式光纖探頭置于酶解料液，在Ocean View軟件中設置采集條件：波長范圍為800～2 500 nm，背景為蒸餾水，透射方式，光程為4 mm，掃描次數為10次，分辨率選定6.4 nm，共有256個變量。每個樣本連續采集3次光譜，取其平均值作為該樣本的原始光譜。酶解過程中每3 min采集一次光譜，與實時取樣一致。背景光譜的采集條件除了將酶解料液換成蒸餾水外，其他與酶解時條件一致。光譜數據以文本格式發送至上位機。

2.2.3 ACE抑制率測定 將酶解過程中采集的90個樣品按照吳瓊英等[15]的方法測定ACE抑制活性。取10 μL 酶解液的上清液溶于25 μL的ACE溶液，37 ℃下預熱10 min，加入HHL溶液后反應30 min，之后立即加入1 mol/L 的HCl溶液終止反應。反應溶液利用高效液相色譜儀分析并測定馬尿酸的生成量。用雙蒸餾水代替酶解產物作為空白樣。ACE抑制率的計算公式為：

(1)

式中：

IACE——血管緊張素轉換酶抑制率，%；

A1——空白樣對照中馬尿酸的面積，mAU·s；

A2——加入大米蛋白酶解產物樣品的馬尿酸的峰面積，mAU·s。

2.2.4 模型建立與終點控制 將采集的90個光譜進行多元散射校正預處理，以消除散射影響。再將光譜集分為校正集(75個)和預測集(15個)，采用聯合區間最小二乘法結合實際測得的ACE抑制率建立校正模型和預測模型，方法參照文獻[16]。對采集到的光譜進行預處理后篩選區間，建立校正模型。再對需要預測的樣品酶解，過程中采集光譜并進行平滑處理，然后利用已經建立的校正模型(預測模型)進行預測。酶解過程的原位實時監測流程如圖5所示。

將得到的ACE抑制率預測值在Matlab中進行迭代運算。終點控制以兩個參數為指標，一個為n個ACE抑制率預測值的平均值，另一個為相鄰兩個ACE抑制率預測值平均值的差，計算公式如式(2)和式(3)所示。

(2)

(3)

式中：

xi——第i次預測值；

em——相鄰兩次預測值的平均值之差。

圖5 酶解過程的原位實時監測流程Figure 5 Flow of In-situ real-time monitoring inenzymatic hydrolysis process

圖6 終點判斷流程Figure 6 End-point determination process

2.3 結果與分析

將建立的模型應用于酶解過程，對實時采集的光譜預測化學值。圖7為單頻、雙頻和三頻模式下在酶解終點時得到的ACE抑制率預測值和實測值對比圖。超聲輔助酶解控制系統在28 kHz單頻時酶解時長為78 min，終點時的ACE抑制率預測值為65%，實測值為63.67%，27組數據之間的相關系數R2值0.842 6。順序雙頻20 kHz/28 kHz模式下得到酶解時長為72 min，終點時的ACE抑制率為68.70%，預測值為60%，25組數據之間的相關系數R2值為0.889 6。順序三頻20 kHz/28 kHz/35 kHz模式下得到酶解時長為105 min，終點時的ACE抑制率為65.72%，預測值為61%，36組數據之間的相關系數R2值為0.901 6。可以看出，3種模式下的預測值和實測值相關性均較高，預測效果良好。以ACE抑制率為指標，發現3種頻率模式中順序雙頻20 kHz/28 kHz 的酶解效果最好，時間最短，抑制率最高。

圖7 ACE抑制率的預測值與實測值Figure 7 Predictive value and measured value of ACE inhibitory rate

3 結論

試驗以可編程邏輯控制器為核心，對超聲陣列輔助酶解過程進行設計和優化，通過人機交互終端操作，完成了超聲的多模式快速選擇與切換。同時，將化學計量學方法—近紅外光譜原位監測、Matlab數學運算與通信和可編程邏輯控制技術結合，完成了大米蛋白超聲輔助酶解過程中以血管緊張素轉換酶抑制率為指標的終點控制，改善了傳統酶解需要離線測定化學值、效果不可預知的狀況。該系統為超聲輔助酶解過程提供了多種模式，后期考慮將該系統應用于不同蛋白酶在植物蛋白酶解過程中的柔性切換的控制，以達到更好的酶解效果。