大黃魚小清蛋白提取工藝優(yōu)化及免疫印跡分析

呂春霞 楊留明 陳世達(dá) 張慧恩 楊 華

(浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)，硬骨魚綱鱸形目石首魚科黃魚屬[1]，俗稱黃花魚、桂花魚等，是中國近海主要的經(jīng)濟(jì)魚類[2]。但是其含有致敏原小清蛋白，可對人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)。

水產(chǎn)食物的主要過敏原多屬糖蛋白，其熱穩(wěn)定性較高，分子量為10～70 kD，如小清蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌鈣結(jié)合蛋白等[3]。小清蛋白(parvalbumin, PV)是多數(shù)魚類中確定的主要過敏原[4-6]，其中大部分為硬骨魚類。研究表明，鱈魚過敏原中的4個(gè)抗原亞組分中，pI 4.75的過敏原M即為PV[7-8]，是鱈魚的主要過敏原[9]。Kobayashi等[10-11]在沙丁魚、馬鮫魚、紅綢魚及太平洋鯖等魚類的白色肌肉組織中發(fā)現(xiàn)了含量豐富的PV，其深色肌肉組織中也有較低濃度的PV。

小清蛋白是穩(wěn)定性較高的蛋白，對酸堿度、溫度和各種變性劑都有很強(qiáng)的耐受性，由于小清蛋白分子構(gòu)象、折疊能力和抗原表位的不同及特殊性，其在酶解和高溫條件下均很穩(wěn)定，并仍具有過敏性[12-13]。蛋白質(zhì)會(huì)受到游離基作用發(fā)生氧化，從而改變其蛋白功能特性[14]6-7，而脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基遷移可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集。目前國內(nèi)外有關(guān)小清蛋白的研究[15-16]較多，而關(guān)于大黃魚小清蛋白的研究較少，吳玟靜等[17]以阿拉斯加狹鱈、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、大黃魚等7種魚為原料，證明了魚類過敏原主要為48～57，33～41，28，17 kU的蛋白，并通過間接ELISA和抑制性ELISA證實(shí)了不同魚類蛋白之間存在強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)。目前由過敏原直接引起的過敏性疾病呈大幅增加趨勢[18]。試驗(yàn)擬先對大黃魚小清蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對其進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，以期為后續(xù)大黃魚小清蛋白的理化特性及致敏機(jī)理的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大黃魚：市售；

改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

十二烷基磺酸鈉(SDS)、10% SDS、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.8)、1.0 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=6.8)、30%丙烯酰胺(29∶1)、5×SDS-PAGE上樣緩沖液、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、甘氨酸(Gly)、羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、考馬斯亮藍(lán)R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250：分析純，北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；

吐溫20：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體PARV-19：美國Sigma公司；

鮭魚小清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：PL2002型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

雙室真空包裝機(jī)：DZ-400型，寧波江東明興包裝設(shè)備物資有限公司；

恒溫水浴鍋：DK-8D型，上海維誠儀器有限公司；

垂直電泳儀：DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，美國Thermo公司；

漩渦混勻器：XW-80A型，西寶生物科技有限公司；

冷凍干燥儀：ALPHA2-4型，上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Avanti J-26XP型，美國貝克曼庫爾特；

三清超微粉碎機(jī)：SQW-6DI型，山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 養(yǎng)殖大黃魚去頭后以背鰭線下刀，將魚肉體與主骨、脂肪層和內(nèi)臟分開，尖刀剔離魚皮，拔出魚刺，冰水洗凈，超微粉碎機(jī)攪碎，真空包裝，-40 ℃凍藏。

1.2.2 脫脂處理 參照夏珊珊等[19-21]的方法并修改。以預(yù)處理魚糜為原料，選取正丁醇、乙酸乙酯、氯仿+甲醇(V氯仿∶V甲醇=1∶1)、異丙醇、乙醚+乙醇(V乙醚∶V乙醇=1∶1)、40 g/L Na2CO3溶液作脫脂劑，料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶10 (g/mL)，提取溫度20 ℃，提取時(shí)間24 h，并以預(yù)處理魚糜為對照組。測定其脂肪含量和總蛋白濃度，計(jì)算脫脂后各組脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)及蛋白濃度，選擇最佳脫脂溶劑。

1.2.3 脂肪含量測定 按GB 5009.6—2016執(zhí)行。并按式(1)計(jì)算樣品(干基)脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(1)

式中：

X——樣品中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的質(zhì)量，g；

m0——接收瓶質(zhì)量，g；

m2——樣品干重質(zhì)量，g。

1.2.4 蛋白濃度測定 采用Bradford法。

1.2.5 小清蛋白粗提取 根據(jù)陸宗超[14]27的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取魚糜(1.00±0.01) g，與50 mmol/L、pH 7.0 的Tris-HCl緩沖液以料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶40 (g/mL)混勻，30 ℃下浸提42 h，4 ℃、8 500 r/min離心15 min，取上清液即得大黃魚肌漿蛋白溶液。肌漿蛋白于沸水中水浴40 min，8 500 r/min離心15 min，上清即為小清蛋白粗提物。上清中加入75% (NH4)2SO4靜置2 h，待析出絮狀物后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取沉淀以0.02 mol/L Tris-HCl復(fù)溶，透析脫鹽，得小清蛋白粗提物。

1.2.6 小清蛋白提取液選擇 選用50 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.5)、50 mmol/L Tris-HCl—50 mmol/L Gly—1 mmol/L DTT(pH 7.5)和50 mmol/L Tri-HCl—50 mmol/L Gly (pH 7.5)溶液，以1 mol/L KCl溶液作為高濃度提取液的對比，提取方法參照1.2.5。

1.2.7 單因素試驗(yàn)

(1) 提取液濃度：準(zhǔn)確稱取魚糜1.00 g，脫脂，固定提取液pH 7.0、料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取溫度30 ℃、提取時(shí)間42 h,考察提取液濃度(20，35，50，65，80，95 mmol/L)對大黃魚小清蛋白得率的影響。

(2) 提取液pH：準(zhǔn)確稱取魚糜1.00 g，脫脂，固定提取液濃度50 mmol/L、料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取溫度30 ℃、提取時(shí)間42 h，考察提取液pH(3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)對大黃魚小清蛋白得率的影響。

(3) 料液比：準(zhǔn)確稱取魚糜1.00 g，脫脂，固定提取液濃度50 mmol/L、提取液pH 7.0、提取溫度30 ℃、提取時(shí)間42 h，考察料液比(m大黃魚∶V提取液)[1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1∶120，1∶140，1∶160，1∶180，1∶200 (g/mL)]對大黃魚小清蛋白得率的影響。

(4) 提取溫度：準(zhǔn)確稱取魚糜1.00 g，脫脂，固定提取液濃度50 mmol/L、提取液pH 7.0、料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取時(shí)間42 h，考察提取溫度(10，20，30，40，50，60 ℃)對大黃魚小清蛋白得率的影響。

(5) 提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取魚糜1.00 g，脫脂，固定提取液濃度50 mmol/L、提取液pH 7.0、料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取溫度30 ℃，考察提取時(shí)間(10，18，26，34，42，50，58，66，74，84 h)對大黃魚小清蛋白得率的影響。

1.2.8 小清蛋白得率測定 按式(2)計(jì)算小清蛋白得率。

(2)

式中：

X——小清蛋白得率，%；

m0——分離純化后樣品質(zhì)量，g；

m——魚糜質(zhì)量，g。

1.2.9 響應(yīng)面試驗(yàn) 參照李曉等[22-23]的方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert v8中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察提取液濃度、提取液pH、料液比、提取溫度4個(gè)因素對小清蛋白得率的影響。

1.2.10 陰離子柱層析純化小清蛋白粗提物 參照劉光明等[24]的方法并修改。采用HiPrepTM(16/10)DEAE FF陰離子柱GE層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化小清蛋白粗提物。控制系統(tǒng)為KTA pure LI protein purification system(GE Healthcare Uppsala Sweden)系統(tǒng)；洗脫A液為pH 7.5，0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液；洗脫B液為pH 7.5，0.5 mol/L NaCl—0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液。每2 mL收集一次，測定洗脫液在220，280 nm處吸光值。收集的目的蛋白溶液用HiPrepTM(26/10)Desalting柱脫鹽，冷凍干燥，凍干粉-40 ℃貯藏。

1.2.11 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 采用Ulrich[25]的方法制備1.5 mm不連續(xù)SDS-PAGE凝膠，根據(jù)小清蛋白的分子量選擇配制15%分離膠，5%濃縮膠，采用60 V恒壓進(jìn)行濃縮膠的電泳，90 V恒壓進(jìn)行分離膠的電泳。結(jié)束后取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h，脫色至膠片背景清晰，凝膠成像。

1.2.12 免疫印跡分析 參照Kanna等[26-27]的方法，采用免疫印跡檢測大黃魚小清蛋白過敏原的免疫活性。SDS-PAGE凝膠電泳后，進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

除陰離子柱層析曲線外，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以Mean±SD表示。采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用Tukey法分析均值的差異顯著性，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用GraphPad prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂條件優(yōu)化

由圖1、2可知，與對照組相比，正丁醇、乙酸乙酯、氯仿+甲醇、異丙醇、乙醚+乙醇、Na2CO3組脫脂效果顯著(P<0.05)；正丁醇、氯仿+甲醇、異丙醇組的蛋白濃度較接近(P<0.05)，表明這3種脫脂方法蛋白損失率較低，且脫脂后10 kDa的小清蛋白灰度接近于對照組，故選擇正丁醇進(jìn)行脫脂處理。

2.2 大黃魚小清蛋白粗提取

由圖3可知，Tris-HCl-Gly-DTT、Tris-HCl-Gly、PBS、KCl組的蛋白質(zhì)量濃度分別為433.59，402.20，391.78，374.03 μg/mL，且差異顯著(P<0.05)。

由圖4 可知，高濃度溶液對10 kDa蛋白濃度的提取效果較差，反而會(huì)增加雜蛋白濃度，由于加入還原劑DTT可以減少小清蛋白的氧化，提高抽提蛋白的含量和免疫活性[14]13-15，使加入DDT的提取液雜蛋白條帶較少，所以選用Tris-HCl-Gly-DTT作為提取液。

2.3 單因素試驗(yàn)

由圖5可知，提取液濃度對小清蛋白得率影響較為明顯，當(dāng)Tris-HCl緩沖液濃度為20～95 mmol/L時(shí)，小清蛋白得率隨其濃度升高呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)Tris-HCl緩沖液濃度為65 mmol/L時(shí)，小清蛋白得率最高。提取液pH對小清蛋白得率影響較為明顯，當(dāng)Tris-HCl緩沖液pH為3.5～10.0時(shí)，小清蛋白得率先上升后下降，當(dāng)pH為6.0時(shí)，小清蛋白得率達(dá)最高；當(dāng)pH為3.5時(shí)，小清蛋白得率接近于0，推測小清蛋白的pI為3.5，而Elsayed等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)鱈魚過敏原M(PV)的pI為4.75，略高于試驗(yàn)測定值。當(dāng)料液比(m大黃魚∶V提取液)為1∶40～1∶140 (g/mL)時(shí)，小清蛋白得率先升高后降低，當(dāng)料液比(m大黃魚∶V提取液)為1∶120 (g/mL) 時(shí)，小清蛋白得率達(dá)最高。當(dāng)提取溫度為10～60 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，小清蛋白得率先升高后降低，當(dāng)提取溫度為20 ℃時(shí)，小清蛋白得率達(dá)最高。由于提取溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，在不破壞蛋白結(jié)構(gòu)的前提下提高了蛋白溶出率，但當(dāng)提取溫度>20 ℃時(shí)，繼續(xù)升高提取溫度，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生變化且在一定程度上發(fā)生變性沉淀，蛋白質(zhì)溶出量減少，得率下降[28]。當(dāng)提取時(shí)間為42 h時(shí)，小清蛋白得率達(dá)較大后趨于平穩(wěn)，故固定提取時(shí)間為42 h。

與對照組相比，* P<0.05，** P<0.01；與正丁醇組相比，# P<0.05，## P<0.01圖1 脫脂方法對大黃魚脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)量濃度的影響Figure 1 Effects of different degreasing methods on fat content and protein concentration of Pseudosciaena crocea

1. Na2CO3組 2. 乙醚+乙醇組 3. 氯仿+甲醇組 4. 正丁醇組 5. 異丙醇組 6. 乙酸乙酯組 7. 對照組 M. Marker圖2 大黃魚脫脂后SDS-PAGE電泳圖Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of the large yellow croaker protein extracts after degreasing

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 提取液種類對大黃魚小清蛋白濃度的影響Figure 3 The effect of the type of extract on the concentration of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 模型及顯著性分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取液濃度、提取液pH、料液比和提取溫度為試驗(yàn)因素，以小清蛋白得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design Expert v8軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得二次多項(xiàng)式回歸方程：

M. Marke 1. PBS 2. Tris-HCl-Gly-DTT 3. Tris-HCl-Gly 4. KCl圖4 大黃魚小清蛋白粗提物SDS-PAGE電泳圖Figure 4 SDS-PAGE electrophoresis of crude extract of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 各因素對大黃魚小清蛋白提取率的影響Figure 5 Effects of different extraction factors on the extraction rate of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

Y=9.388 3×10-2+1.282 9×10-3A-4.850 1×10-2B+7.518 98×10-5C-3.337 15×10-4D-6.259 77×10-5AB+5.556 6×10-7AC+1.162 84×10-5AD+3.006 13×10-5BC+1.869 81×10-4BD+2.448 38×10-6CD-9.962 15×10-6A2+3.466 13×10-7B2-3.466 13×10-7C2-2.219 72×10-5D2。

(3)

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知，失擬項(xiàng)P=0.399 1，不顯著，表明該回歸模型的預(yù)測值與實(shí)際值擬合較好。模型P<0.01，表明該模型極顯著，試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可行。R2=92.41%，說明各因素存在線性相關(guān)，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。因此，可以采用該模型分析和預(yù)測不同條件下的提取率。各因素對小清蛋白得率的影響順序?yàn)樘崛∫簼舛?提取溫度>料液比>提取液pH。一次項(xiàng)B和C與二次項(xiàng)B2對小清蛋白得率影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)D對小清蛋白得率影響顯著(P<0.05)。

2.4.2 因素間的交互影響 各因素變量之間的交互作用對響應(yīng)值——小清蛋白得率的響應(yīng)面三維圖如圖6所示，其中提取液濃度和提取液pH、提取液濃度和提取溫度、料液比與提取液pH、提取溫度和提取液pH的交互作用響應(yīng)面曲面坡度陡峭，說明其對大黃魚小清蛋白得率影響顯著。

2.4.3 最優(yōu)工藝條件的確定及模型驗(yàn)證 通過響應(yīng)面法得到大黃魚小清蛋白的最優(yōu)提取工藝為提取液濃度72 mmol/L、提取液pH 8.0、料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶180 (g/mL)、提取溫度50 ℃，此條件下的小清蛋白得率為0.174 2%(n=3)，與理論預(yù)測值0.181 1%基本相符，說明該回歸方程能真實(shí)反映各因素對小清蛋白得率的影響。孫妙[29]研究表明，大菱鲆魚肉中的過敏原小清蛋白得率為0.286%，可能是因?yàn)轸~種不同。

表3 提取工藝回歸模型方差分析表?

圖6 各因素對小清蛋白得率的交互作用Figure 6 Response surface optimization map

2.5 大黃魚小清蛋白粗提物陰離子柱層析純化

試驗(yàn)表明，大黃魚小清蛋白提取液在220 nm處的吸收峰遠(yuǎn)高于其他波長，這可能與小清蛋白缺少在280 nm處有吸光值的色氨酸有關(guān)[30]。故在220 nm下測定小清蛋白的洗脫曲線，共分離得到4個(gè)明顯的洗脫組分(見圖7)。

由圖8可知，洗脫峰1、2的蛋白含量較高且成分單一，分子量約為10 kDa，與陸宗超[14]38報(bào)道的小清蛋白分子量相符。結(jié)合圖7和圖8可知，大黃魚小清蛋白的最高鹽濃度為0.5 mol/L，當(dāng)鹽濃度為0.16 mol/L時(shí)停止目的樣品的收集。

2.6 小清蛋白的免疫印跡確認(rèn)

小鼠抗蛙單克隆小清蛋白抗體PARV-19，是目前商用化的已被證實(shí)并被使用的單克隆抗體，已被用于確認(rèn)鯉魚、鯰魚、鱈魚和羅非魚中的小清蛋白。由圖9可知，純化后的大黃魚小清蛋白可在分子量10～12 kDa處與小鼠抗蛙單克隆抗體出現(xiàn)明顯的特異雜交顯色條帶，據(jù)此判定純化的蛋白樣品即為小清蛋白。

圖7 大黃魚小清蛋白陰離子柱層析洗脫圖Figure 7 Parvalbumin of Pseudosciaena crocea anion column chromatography elution map

3 結(jié)論

采用熱肌漿蛋白熱提取和陰離子柱層析的方法研究了養(yǎng)殖大黃魚小清蛋白的提取工藝，此時(shí)的洗脫液鹽濃度為0.16 mol/L。提取前進(jìn)行脫脂處理，大大減少了其他雜質(zhì)，提高了小清蛋白的純度，而還原劑二硫蘇糖醇的添加，減少了小清蛋白的氧化，提高了其提取得率。響應(yīng)面優(yōu)化確定的養(yǎng)殖大黃魚小清蛋白最佳提取工藝條件為提取濃度72 mmol/L，提取液pH 8.0，料液比(m大黃魚∶V提取液)1∶180 (g/mL)，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間42 h，此條件下小清蛋白得率為0.174 2%；采用免疫印跡法分析小清蛋白的分子量約為12 kDa。由于小清蛋白的分離純化技術(shù)較為復(fù)雜，其致敏及脫敏機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

M. Marker A. 大黃魚肌漿蛋白 B. 大黃魚小清蛋白熱提取物 1. 第1洗脫峰 2. 第2洗脫峰 3. 第3洗脫峰 4. 第4洗脫峰圖8 大黃魚小清蛋白陰離子柱層析SDS-PAGE電泳圖Figure 8 SDS-PAGE electrophoresis of parvalbumin from Pseudosciaena crocea eluted by anion column chromatography

M. Marker 1. 純化的小清蛋白圖9 小清蛋白的免疫印跡分析Figure 9 Western-blot of parvalbumin