貝類中麻痹性貝類毒素的蓄積及代謝研究進展

呼曉群 解萬翠，2 李 敏 董澤群 楊錫洪，2

(1. 青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學工程重點實驗室，山東 青島 266042)

海洋赤潮中有毒甲藻產生的毒素可經食物鏈蓄積于貝類、魚類等體內，對水產加工產業和公眾健康造成潛在威脅[1-2]。其中，麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Toxins，PSTs)毒性強、分布廣、衍生物多，甚至在北極楚科奇海和臨近北極的白令海的底棲軟體動物也被PSTs污染[3]。中國最近一次的PSTs中毒事件發生在2019年5月，河北省秦皇島等地發生赤潮，期間有人疑似食用受PSTs污染的貽貝引起中毒。麻痹性貝類毒素通過阻斷神經細胞膜上的鈉通道和抑制動作電位的轉導來攻擊神經系統。PSTs主要源自淡水藍藻和海洋鞭毛藻，如亞歷山大藻屬(Alexandrium)、裸甲藻屬(Gymnodinium)等。雙殼貝類由于其濾食性特征能過濾海水攝食有毒藻，并通過食物鏈中的營養轉移導致人類麻痹性貝類毒素中毒。近年來海洋污染加劇有害赤潮頻發，由此導致的PSTs污染及中毒事件日益受到人類的關注。

科研人員[4-7]在實驗室條件下模擬雙殼貝類在自然條件下攝食有毒藻的過程，研究了PSTs從毒藻到貝類的蓄積、轉化及排出過程。文章擬從PSTs的蓄積、轉化、代謝及凈化對麻痹性貝類毒素的相關研究進行綜述。

1 PSTs食物鏈蓄積的特異性

PSTs可通過食物鏈富集于許多海洋生物中，包括雙殼類、棘皮動物、甲殼類動物、被囊動物、頭足類動物、腹足動物和魚類等，其蓄積具有物種特異性。Terrazas等[8]對智利部分海域的水生生物進行了STX毒素組的毒性分析，發現毒素含量為巖石地層雙殼類>沙地雙殼類>腹足類>被囊類>棘皮類動物>頭足類>魚類，且毒素含量較高的為膝溝藻毒素(GTX3/GTX2)>石房蛤毒素(STX)>膝溝藻毒素(GTX4/GTX1)>新石房蛤毒素(neoSTX)>脫氨甲?；扛蚨舅?dcSTX)。說明PSTs在整個食物鏈中的主要傳遞媒介為雙殼貝類，與之相比，魚類對PSTs的敏感程度比貝類更敏感，貝類可以累積一定量的毒素而本身無明顯不利反應，但毒素在魚體內較低水平累積便可導致魚類死亡。

貝類濾食產毒藻不具有選擇性，只要藻細胞大小合適，即可進入貝體內，PSTs最先累積在消化系統，之后隨血液流動分散至其他組織。貝類蓄積PSTs的能力存在差異性，受貝種類、大小、暴露毒素期間的生理狀態以及環境狀況的影響，并且與其生長階段有關[9]。

毒素除蓄積含量有物種特異性外，在不同組織中的毒性分布也具有特定性。一般情況下，貝的運動組織如閉殼肌等蓄積PSTs較少，消化腺或內臟團是貝體內PSTs累積最多的部位，蓄積含量最高可占貝體內總毒素的98%，同時消化系統中毒素的排出也相對其他組織要快[10-11]，且PSTs在不同雙殼貝類組織中的蓄積含量存在差異，這與不同貝類之間對有毒藻的消化吸收差異及選擇性排出有關。Andres等[12]研究發現，前18 h內毒素主要存在于貽貝的外套膜中，之后逐漸向腸道轉移，24 h后其主要蓄積部位為消化系統。Li等[13]對中國黃海北部的扇貝和蛤蜊進行了毒素分析，發現PSTs主要累積在扇貝的消化系統中。Estrada等[14]用G.catenatum喂食扇貝(Nodipectensubnodosus)，發現消化腺中的PSTs濃度最高，其次是唇瓣、腸、鰓、外套膜和閉殼肌，內臟中的毒素含量超過了貝體的80%。邴曉菲等[15]將櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)直接暴露于產毒藻，發現貝體存在PSTs累積和生物轉化，不同器官的PSTs累積含量按內臟團、性腺、外套膜和閉殼肌的順序依次降低。Oyaneder等[10]對智利部分海域的雙殼貝類不同組織中的毒素進行分析發現，各組織毒素含量為消化腺(81.5%)>斧足(8.6%)>外套膜(5.3%)>閉殼肌(4.6%)。厚蛤蜊[16]、麥哲倫海扇貝[17]以及薪蛤[18]、櫛孔扇貝[19]等貝類中的閉殼肌是累積毒素最少的組織。但毒素的蓄積規律在某些種類的貝中存在例外，如奶油蛤(Saxidomusgiganteus)將其毒素集中在含黑色素較多的進出水管[20]。

2 PSTs的生物轉化

PSTs是一類四氫嘌呤三環化合物毒素的總稱，由STX及其衍生物組成，衍生物種類繁多，結構復雜多樣，且在特定條件下可以發生相互轉化，并對生物體內的代謝產生影響。

2.1 PSTs的分類

1957年，STX毒素首次從阿拉斯加石房蛤(Saxidomusgigangteus)中被分離出。由于STX高極性特征使其具有較差的結晶條件，因此阻礙了其結構的闡明，直至1975 年Bordner和Schantz兩個團隊確定了STX的結構(見圖1)。自發現以來，在多種生物體中相繼發現多種天然存在的STX類似物，統稱為PSTs(見表1)。

圖1 麻痹性貝類毒素的化學結構式Figure 1 Chemical formula of paralytic shellfish toxins

表1 麻痹性貝毒的種類及結構

續表1

對已發現的STX及其衍生物根據各可變取代基的不同進行分類命名，根據R4基團的不同可將常見的毒素分為4類：氨基甲酸酯毒素、N-磺酰氨甲酰基毒素、脫氨甲?；舅亍⒚撗趺摪奔柞；舅?。此外，PSTs衍生物還包括N-羥基衍生物、鞘絲藻毒素(LWTX1-6)[21]、Zetekitoxin AB[22]、安息香酸鹽衍生物(GC1-6，GC1-6a，GCb1-6b)[23]，以及PSTs在貝類體內的新型代謝產物(M1-12)[13,24-27]等，其中毒性最高的一類為氨基甲酸酯類毒素。

PSTs的結構由于碳骨架的存在較為穩定，但在一定條件下各可變取代基較易發生生物轉化。C11上的R2，R3取代基存在同分異構現象，此外，毒性較小的PSTs也可轉化為毒性較大的類似物(如C-毒素→GTXs類)，反之亦然。因此，為了更準確地預測毒性水平，需更清楚地了解PSTs的相互轉化。

2.2 PSTs的相互轉化

PSTs在貝類的累積傳遞過程中會發生轉化反應，且這種生物轉化能力存在明顯的種間差異，常見的蛤類、扇貝有較強的PSTs轉化能力，而牡蠣、貽貝和其他貝類的PSTs轉化能力相對較弱。田華等[4]通過培養A.minutum得到PSTs，研究了3種貝類的內臟、肌肉組織中PSTs的體外轉化反應，包括菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)和竹蟶(Solenstrictus)，發現PSTs的體外轉化存在明顯的種間差異和組織特異性，其中Chlamysfarreri內臟對PSTs的轉化能力最強，Ruditapesphilippinarum和Solenstrictus的內臟和肌肉對PSTs幾乎無轉化能力。類似地，邴曉菲等[15]研究指出，內臟團是扇貝體內PSTs蓄積和代謝的主要組織。

天然存在的PSTs可以通過各種生物學因素進行結構修飾，而貝類的生物轉化會得到一些新的藻類不能單獨合成的PSTs產物，根據已有研究[17,26,28-30]，PSTs在貝內的轉化(圖2)主要包括① C-11位羥基磺酸基的差向異構化：甲藻細胞內以β型(C2、C3、GTX3、GTX4)為主的毒素在經貝類濾食后會向更穩定的α型毒素(C1、C4、GTX2、GTX1)轉化，染毒2～5周后α∶β型毒素的比例趨于穩定，約為3∶1；②N-1或C-11位的還原反應：存在于貝類體內的天然還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸等可促使PSTs分子中N-1位-OH或C-11位-OSO3H基團脫去，如NEO轉化為STX，C1/2、C3/4轉化為GTX5、GTX6；③ 水解反應：N-磺酰氨甲?；舅?GTX5、GTX6和C1-4)在貝體內或者低pH、溫度升高的條件下可轉化為相對應的氨基甲酸酯類毒素(STX、NEO和GTX1-4)，該轉化會導致貝類總毒性升高；④ 酶促反應：從雙殼貝類體內分離出的氨甲?；饷改艽呋疪4基團的氨甲?；騈-磺酰氨甲酰基水解，轉化為相應的脫氨甲?；惗舅?GTX1/4→dcGTX1/4、GTX2/3→dcGTX2/3以及C1/2→dcGTX2/3)，且β型有比α型毒素更快的水解速率；⑤ C-11位的羥基化：貝類中的PSTs脫掉C-11位的亞硫酸根，生成一個羥基或兩個羥基的衍生物(M-毒素)。

圖2 PSTs的生物轉化Figure 2 Biotransformation of different types of PSTs

近年來，隨著檢測技術和結構解析方法的改進，新型PSTs有所增加。Quilliam等[31]建立了親水交互作用液相色譜電噴霧串聯質譜(HILIC-ESI-MS)法，可同時分析主要的PSTs毒素。Dell’Aversano等[25]采用HILIC-ESI-MS法發現貽貝中存在毒藻中不存在的5種毒素類似物(M1～M5)，并通過串聯質譜、1D和2D-NMR光譜以及化學互轉換試驗確定了M1～M4的結構。Li等[13]在中國北部沿海采集的有毒扇貝(Patinopectenyessoensis)和蛤(Saxidomuspurpuratus)中使用HILIC-ESI-MS法檢測到M1、M3和M5，以及3個未報告的假定代謝物M6、M8和M10。Ding等[26]收集并分析了2016年4月秦皇島中毒事件中的致病貽貝(Mytilusgalloprovincialis)毒素含量，檢測到濃度較高的新代謝物M2、M8和M10，微量的M4和M6，且在塔瑪亞歷山大藻ATHK藻株喂養的貽貝中檢測到了新型代謝產物M1、M2、M3、M7、M8和M9，這些產物大多毒性較低，其是否存在未發現的新型M類毒素結構還有待研究。

根據化學結構(分子量和產物離子譜)可以對各種新型代謝產物的形成進行推測，Ding等[26]研究表明M1和M3可能是由C2轉化而來(如圖3所示)，而M7和M9可能是由C3/4轉換而來。此外，代謝物M2、M4和M6可能是GTX2/3的產物，而代謝物M8和M10可能來自GTX1/4；為了更具體地研究N-磺?；奔柞；惗舅氐拇x轉化，采用僅產生C1/2和GTX5(暴露于更簡單的PSTs譜)的塔瑪亞歷山大菌TIO108喂養未污染的貽貝，由于C1/2毒素的代謝，貽貝中產生了M1和M3。Che等[32]進一步證實了化學轉化途徑M1→M3→M5，并確定了兩個新的轉化途徑：M2→M4→M6和NEO→M10。

2.3 氧化應激和體內代謝

PSTs與其他主要海洋污染物(重金屬、多環芳烴、多氯聯苯和DDT)一樣，在進入貝類或魚類等生物體后，會增加細胞內自由基水平，特別是增加活性氧(ROS)水平，當ROS的產生超過抗氧化防御時，將誘導嚴重的氧化應激，可能導致生物分子如DNA、蛋白質、脂類和其他物質的氧化損傷，同時，PSTs還會導致雙殼類動物發生各種生化和細胞變化，包括抗氧化反應、免疫防御和解毒過程，但生物體可通過調節自身的抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px、GSH-Rd)活力變化以減少危害[33-35]。

圖3 由C2轉化為M1和M3的生物轉化示意圖Figure 3 Determined biotransformation pathway of metabolites M1 and M3 from C2

邱江兵[36]通過模擬蝦夷扇貝和紫貽貝濾食塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense，ATHK)發現，在PSTs的積累和凈化時期，活性氧ROS迅速生成并消失在扇貝和貽貝組織中，兩種不同的雙殼類中的活性氧ROS發生了不同的抗氧化酶反應。扇貝組織中，SOD活性明顯受到抑制，而有毒藻對CAT活性沒有刺激作用；貽貝組織中，SOD和CAT活性均被誘導，能有效清除超氧陰離子自由基和H2O2，體現了喂養產毒藻A.tamarense的扇貝和貽貝的抗氧化酶的物種特異性反應。Melegari等[37]將Neu-ro-2A細胞和綠藻Chlamydomonasreinhardtii暴露于STX，通過定量丙二醛水平作為脂質過氧化的生物標志物，發現STX可以誘導脊椎動物細胞系的嚴重氧化應激。

牡蠣(Crassostreagigas)對A.minutum的生理反應非常復雜，涉及多種代謝系統，包括基于谷胱甘肽和鐵的代謝系統，以及其他解毒和/或抗氧化系統，并且指出負責呼吸和過濾的鰓作為雙殼類貝類與海水接觸的第一個器官，可能對A.minutum產生的細胞外毒素反應強烈而產生基于谷胱甘肽的解毒途徑。與喂養無毒藻的牡蠣相比，太平洋牡蠣(Crassostreagigas)鰓中編碼抗氧化/解毒酶的7個基因的mRNA[如σ-谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，谷胱甘肽還原酶(GR)和鐵蛋白(Fer)]的轉錄水平顯著提高。 GST、GR和Fer還可以促進抗氧化功能，以防止增加的ROS對細胞的損害，這些活性氧或直接來自A.minutum細胞，或來自免疫應答期間的牡蠣血細胞，或來自作為解毒副產物的其他鰓細胞[7]。Costa等[38]研究表明，裸甲藻G.Catenatum細胞被轉移至其他器官前保留在鰓中，由此產生一系列的消除和生物轉化途徑。Xie等[39]通過15N同位素替換A.minutum培養基中的14N，以15N標記PSTs以期將15N-PSTs作為生物標志物示蹤PSTs在貝類體內的代謝。目前，PSTs在雙殼貝類體內的代謝機制仍不明確，其在雙殼貝類體內代謝的差異代謝物的篩選對其代謝機制的明確具有重要意義。

3 PSTs的消減及凈化

不同貝類對PSTs的積累能力存在較大差異，貝類毒素排出的速率因物種差異和季節不同而存在明顯差異[40]。與扇貝相比，牡蠣和貽貝表現出較快的解毒速度。Takata等[41]發現牡蠣在流動海水中存活48 h內排出62%的麻痹性貝類毒素。扇貝由于代謝率低，對PSTs的敏感性低導致其在組織中積聚毒素的程度更大，且在有毒藻華停止后，扇貝中的毒性滯留仍可持續數月之久[42]。Braga等[43]發現海水變暖和酸化會觸發貝類產生不同的適應機制，適應升溫的貽貝顯示較低的積累/消除率，而適應酸化的貽貝顯示更高的積累毒素能力，但清除率更高。

貝類中PSTs的凈化方式可歸結為化學法、生物學法和物理法[44]。根據化學法規對PSTs的氯水降解是歐洲委員會批準的一種凈化受污染產品的方法，但該方法存在氯殘留或副產品等問題[45-46]。生物學方法是利用微生物代謝[47-48]或酶[49-50]轉化貝類中的PSTs，但該方法存在效率低、成本高等問題。物理凈化是通過加熱、吸附和臨時凈化來消減PSTs的方法。暫養凈化期間，PSTs的排泄率受貝類品種[49]影響。食用無毒藻類可加速毒素排出[51]。由于加熱會改變貝類材料的性能，生物吸附法已成為去除PSTs[52]的研究熱點。

殼聚糖[5]、殼聚糖覆膜的貝殼粉[53]、黏土[54]、活性炭[55]和海藻多糖[56]等均可用作吸附PSTs的吸附劑。Xie等[5]發現殼聚糖對牡蠣(OstrearivularisGould)凈化去除PSTs的效果顯著。Qiu等[55]比較了8種不同粒徑的活性炭對PSTs的吸附效果，發現活性炭能有效加速麻痹性貝毒的脫除。Li等[54]發現改性黏土的應用可以有效防止濾食性雙殼類攝入有毒藻類，并通過沉積物來減少毒素的積累，且沉積物中積累的毒素比扇貝組織中的毒素更快解毒。Romero等[57]制備了一種磁性共價有機骨架(COF)，將該復合材料應用于海水中海洋生物毒素的磁力固相萃取，其效率較高。綜上表明，添加生物吸附劑可提高PSTs從染毒貝類中的排出速度。不同的吸附劑對PSTs的吸附機理不同，活性炭在吸附時，靜電作用與非靜電作用共同發揮作用，而海藻多糖的主要吸附機制是靜電作用。

4 結論

近年來發現的新型低毒M類毒素被認為是貝類解毒過程的代謝中間體或終產物[34]，以此為貝類體內PSTs代謝的靶標，為研究PSTs在貝類體內的代謝組學奠定了基礎。目前暫無PSTs毒素特效解毒劑，基于PSTs在貝類體內生物轉化及代謝的理論依據，能否將暫養凈化、生物吸附法、微生物代謝等凈化方式進行優化或結合，對水產品進行高效脫毒仍需進一步研究。此外，PSTs在貝類體內蓄積、轉化及代謝機制的明確有助于科學地監測PSTs的危害，為保障食品安全及保護水產品養殖加工產業的健康發展提供科學支撐。