黑豆種皮花青素生理功能、分離純化及應用研究進展

魏心源 陳虹印 程道梅

(成都醫學院公共衛生學院，四川 成都 610500)

黑豆為大豆科草本類植物，不僅富含蛋白質、維生素、礦物質等多種營養物質，還含有豐富的花青素等多酚類化合物。花青素屬于類黃酮，是一種水溶性天然色素，賦予植物紅色、紫色和藍色。黑豆中的花青素主要存在于種皮中。近年來，隨著對花青素抗腫瘤、抗氧化等生理功能的不斷深入研究，其在預防乳腺癌、改善心血管功能方面得到了廣泛應用[1]。黑豆種皮花青素(Black soybean coats anthocyanidin，BSCA)存在含糖基的花色苷及其降解產物花青素苷元兩種形式，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、保護認知功能[6]等多種生理作用，黑豆種皮花青素提取純化技術的改善，使其被廣泛用于醫藥、食品、化妝品等領域。隨著近年來對黑豆種皮花青素越來越多的研究和開發，已然顯示出了其廣闊的應用前景，文章擬就國內外近年來的相關研究進展進行綜述，以期為后續開展黑豆種皮花青素的深入研究及開發應用提供參考。

1 黑豆種皮花青素概述

花青素是一類多羥基酚類物質，其基本的碳骨架結構為C6—C3—C6，由一個2-苯基苯并吡喃環和環上不同取代基組成(圖1)[7]。花青素穩定性較差，通常以結構中游離的羥基與糖通過糖苷鍵結合成為花色苷的形式存在于自然界中。與花青素結合形成糖苷鍵的糖主要有鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，花色苷中的糖苷基還可與有機酸通過酯鍵形成酰基化的花色苷[8]。

花青素的結構分析方法有紫外—可見光譜法[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、質譜技術[11]、核磁共振波普法[12]等。花青素最常見的結構為矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、芍藥素、矮牽牛素和錦葵素[7]，見表1。

黑豆種皮中花青素含量非常豐富，但不同產地黑豆種皮中花青素含量及結構存在差異。張澤生等[13]研究發現，山東、湖北、東北、內蒙古、安徽的黑豆種皮中花青素含量分別為3.61%，4.99%，5.03%，5.58%，5.59%。Zhang等[14]對60種中國黑豆的鑒定結果表明，黑豆種皮中總花色苷含量為98.8～2 132.5 mg/100 g，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷含量最高，占總花色苷的48.8%～94.1%。Choung等[15]使用HPLC法分離鑒定發現韓國10個品種的黑豆種皮花色苷含量和結構不同(見表2)，其主要結構為矢車菊素-3-葡萄糖苷。另有研究[16]發現韓國高海拔地區的黑豆皮中花青素含量高于低海拔地區。

圖1 花青素基本結構Figure 1 Basic structure of anthocyanidin

表1 6種常見花青素結構

表2 10種黑豆種皮中花色苷含量比較[15]

2 黑豆種皮花青素生理功能及其作用機制

2.1 抗氧化作用

黑豆種皮花青素許多重要的生理功能以其抗氧化能力為基礎。在體外黑豆種皮花青素對DPPH自由基、羥自由基、鐵離子螯合劑具有較強的清除作用，且呈明顯的劑量反應關系[17]。體內研究[18]也發現，黑豆種皮花青素在質量濃度為50 μg/mL時即可發揮抗氧化作用，并且呈劑量依賴性降低血清中丙二醛、過氧化氫酶含量，提高超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶含量。細胞學研究[3]發現，經矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為67 mg/g的黑豆種皮提取物預處理可通過激活蛋白質磷酸酶抑制H2O2對HepG2細胞中ERK通路的過度激活，阻止H2O2介導的細胞損傷，通過抗氧化應激發揮抗腫瘤作用。良性前列腺增生是一種老年男性的常見疾病，黑豆種皮花青素可通過清除自由基，預防氧化損傷來防治前列腺增生。Jang等[19]發現經黑豆種皮花青素處理后，增生的前列腺體積減小，組織形態明顯得到改善，其中80 mg/kg 處理組的作用效果最好，提示黑豆種皮花青素在較低劑量時即可發揮抗氧化作用。黑豆種皮花青素是一種良好的抗氧化劑且安全無毒，可廣泛應用于多種環境，對預防疾病、延緩衰老具有重要意義。

2.2 降血糖及改善2型糖尿病作用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是預防和治療2型糖尿病的關鍵物質之一。研究[20]發現，黑豆種皮花青素可激活AMPK通路來增加葡萄糖轉運蛋白的表達，激活肝臟中的AMPK下調肝臟糖異生酶的產生。Chen等[21]用400 mg/kg的黑豆種皮提取物(花青素占比為73.93%)對2型糖尿病模型小鼠處理3～4周，其降血糖作用程度與羅格列酮一致。且在進食后30 min，經黑豆種皮提取物處理可抑制血清胰島素水平異常升高趨勢。糖尿病的發生與脂肪細胞的分化密切相關。黑豆中的矢車菊素-3-葡萄糖苷可通過誘導前脂肪細胞分化為更小且對胰島素敏感的脂肪細胞來改善2型糖尿病[4]。上述研究表明，富含矢車菊素-3-葡萄糖的黑豆種皮提取物可能是一種可用于2型糖尿病治療的功能性食物或藥物。中國成人2型糖尿病患病率高達11.6%，糖尿病患者數居全球首位，已成為嚴峻的公共衛生問題[22]。營養治療是2型糖尿病的首要治療方式，因此，可利用黑豆種皮花青素的降血糖作用對2型糖尿病患者及高危人群進行飲食干預，達到控制血糖、預防疾病的目的。

2.3 預防肥胖及降血脂作用

人群超重和肥胖是目前廣受關注的公共衛生問題，研究發現，黑豆種皮花青素具有潛在的減肥及降血脂功效。Badshah等[23]對大鼠每日灌胃黑豆種皮花青素6 mg/kg 和24 mg/kg持續40 d后顯示，大鼠體重及日攝食量較正常飼料喂養組顯著降低，并以劑量依賴性方式減小脂肪組織大小。蛋白質印跡分析表明，黑豆種皮花青素可能通過降低下丘腦神經肽Y的表達和上調γ-氨基丁酸B1受體(GABAB1R)的表達來降低大鼠的體重以及日攝食量，從而幫助預防肥胖。Lee等[24]對共63名超重或肥胖成年韓國居民進行的一項為期8周的隨機雙盲安慰劑對照試驗結果顯示，在維持高膳食纖維和低膽固醇飲食的情況下，研究對象每日服用富含花青素的黑豆種皮提取物2.5 g，可使腹部脂肪(以腰圍表示)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)及動脈硬化指標TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C均顯著下降。該結果提示，食用花青素含量豐富的食物，可能能夠減少體內脂肪的蓄積，富含黑豆種皮花青素的黑豆種皮可被開發為預防腹部肥胖的功能性食物。實際應用中需要注意的是，黑豆種皮花青素預防肥胖及降血脂作用機制利用的是低劑量、長時期的累積效應來預防和減少脂肪的沉積，因此可能需要較長的周期。

2.4 抗炎、抑菌作用

炎癥是機體發揮自愈功能的一種非特異性免疫反應，慢性炎癥則有可能引發多種疾病。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)在炎癥介質表達的信號轉導過程中具有重要的作用[25]。Kim等[26]利用脂多糖誘導巨噬細胞(RAW264.7細胞)產生炎癥因子，經質量濃度為12.5 μg/mL黑豆種皮花青素預處理可顯著抑制RAW264.7細胞NO的生成，且呈劑量依賴性地抑制促炎細胞因子TNFα和IL-6含量的增加以及前列腺素E2和MAPKs的磷酸化。這些結果表明黑豆種皮花青素可能通過抑制活性氧生成和隨后的MAPK信號傳導而發揮抗炎活性，從而抑制炎癥反應。Yoon等[27]對大鼠滴注大腸埃希氏菌誘導慢性細菌性前列腺炎后，分別給予環丙沙星、黑豆種皮花青素、黑豆種皮花青素+環丙沙星聯合治療，研究發現，與環丙沙星組相比，黑豆種皮花青素+環丙沙星組的細菌生長顯著減少，前列腺炎癥顯著改善。這些結果表明黑豆種皮花青素可能具有抗炎和抑菌作用，且與環丙沙星存在協同作用。

2.5 神經保護作用

神經退行性疾病是老齡化社會面臨的重大公共衛生問題，其發生機制主要是神經元和/或其髓鞘的喪失，隨時間推移發生惡化，進而導致功能障礙。現有研究顯示黑豆種皮花青素具有神經保護作用。用4 mg/kg的黑豆種皮花青素對成年雄性大鼠進行灌胃12 h即能抵抗淀粉樣β蛋白處理引起的細胞活力下降，使細胞內的線粒體膜電位和Ca2+水平恢復正常，并減少神經元細胞的死亡[28]。矢車菊素-3-葡萄糖苷可顯著抑制暴露于氧糖剝奪環境的大鼠初級神經元中活性氧的過度生成，劑量依賴性地阻止氧化應激造成的細胞膜損傷，對大鼠皮質神經元發揮神經保護作用[29]。黑豆種皮花青素還可通過抑制ASK1-JNK/P38通路的激活、清除活性氧、刺激血紅素氧合酶-1表達以及上調Neu1唾液酸酶的基因表達來動員細胞游離唾液酸，從而發揮針對氧化應激的腦神經保護作用[30]。上述研究提示黑豆種皮花青素可能是治療阿爾茲海默癥等神經退行性疾病的潛在候選藥物。

2.6 視覺保護作用

視網膜變性可引起光感細胞死亡，從而導致失明。《本草綱目拾遺》中即有黑豆可明目的記載，現代研究發現其主要功效成分為黑豆中的花青素。Paik等[31]每日經口給予N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)誘導的視網膜變性大鼠50 mg/kg黑豆種皮花青素4周后發現，黑豆種皮花青素處理組大鼠視網膜中光感受器所在的外核層被很好地保存，視網膜電圖反應顯著增加。提示黑豆種皮花青素可保護視網膜神經元的結構和功能。Mok等[32]研究發現，經黑豆種皮花青素預處理可劑量依賴性地抑制H2O2誘導的晶狀體上皮細胞凋亡以及形態學改變，且隨著黑豆種皮花青素含量的增加，形態學異常的細胞比例下降。黑豆種皮花青素發揮視覺保護作用的相關機制尚不明確，但有研究發現桑果中提取的矢車菊素-3-葡萄糖苷通過促進視網膜視桿細胞中視紫紅素再生和增強視網膜毛細血管微循環等途徑發揮對視覺功能的保護作用[33]。中國成人糖尿病視網膜病變患者數為3 200萬～4 800萬，兒童青少年近視檢出率高達50%以上，且近視增速的峰值年齡不斷提前[34]，因此，可以預期黑豆種皮花青素在視力保護方面的應用將會是其相應產品開發的一大熱點。

2.7 其他

2.7.1 抗酪氨酸酶活性 酪氨酸酶可催化人皮膚中黑色素的合成，因此抑制酪氨酸酶的合成可有效抑制黑色素在人類皮膚沉著。Jhan等[35]利用人酪氨酸酶評價黑豆種皮提取物的抗酪氨酸酶潛力，研究表明，黑豆種皮提取物中的總酚類含量、總黃酮含量、矢車菊素-3-葡萄糖苷含量與抗人酪氨酸酶活性間存在良好的相關性，且矢車菊素-3-葡萄糖苷含量與抗人酪氨酸酶活性的相關性最強。

2.7.2 預防放射性皮膚纖維化 Park等[36]在放射處理前后5 d，每天對小鼠注射一次100 μg/mL的黑豆種皮花青素。試驗結束后對小鼠真皮成纖維細胞用50 μg/mL和100 μg/mL的黑豆種皮花青素進行處理，發現在48 h時細胞內活性氧的生成顯著減少，在72 h時輻射誘導的細胞凋亡明顯減少。此外，輻照72 h后，100 μg/mL 黑豆種皮花青素顯著降低Smad3 mRNA表達并增加Smad7 mRNA表達。說明以100 μg/mL黑豆種皮花青素治療小鼠，會顯著減少輻照后皮膚損傷的程度、表皮厚度和膠原沉積。

2.8 黑豆種皮花青素發揮生理功能的劑量

黑豆種皮花青素在發揮各種生理功能時有使用劑量上的差異，表3匯總了使用大鼠對各種生理功能進行體內研究時所用的黑豆種皮花青素劑量和時間，在降血糖研究中所使用的黑豆種皮花青素劑量較大，其他生理功能研究中黑豆種皮花青素劑量相差不大，作用時長均在4周以上。

表3 黑豆種皮花青素發揮生理功能的劑量

3 黑豆種皮花青素分離純化及改性工藝

黑豆種皮花青素具有較高的藥用價值和廣泛的應用前景，然而由于其粗提物含蛋白質等其他成分，影響花青素的穩定性和品質，因此，黑豆種皮花青素的提取純化方法及穩定性保護研究備受關注。

3.1 乙醇浸提法

曹柏營等[17]利用響應面法得到的乙醇浸提法的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，提取溫度60 ℃，提取時間3 h，料液比(m黑豆種皮∶V乙醇)1∶15 (g/mL)，提取率為(1.101±0.101) mg/g。乙醇浸提法存在溶劑用量大、耗時長、花青素提取率低等缺點，近年相繼出現了多種輔助提取及純化技術，改進了黑豆種皮花青素的提取工藝。

3.2 微波輔助提取

利用萃取體系中不同組分對微波的吸收能力不同的特性可使黑豆種皮花青素從萃取體系中分離，進入到微波吸收能力較弱的萃取劑中[37]。此外。微波輻射能夠破壞細胞，使有效成分在較短時間溶出。Kumar等[38]發現微波輔助提取法優于酶輔助提取法和乙醇浸提法，使用功率為569.46 W的微波輔助提取黑豆種皮花青素的最佳條件為：乙醇濃度59.99%，料液比(m黑豆種皮∶V乙醇)1∶40 (g/mL)，提取時間262.54 s，提取率為5 094.9 mg/L。微波輔助提取技術設備簡單、操作方便，與傳統浸提法相比，提取時間更短、提取率更高。

3.3 超聲波輔助提取

超聲提取法是通過超聲波產生的強烈振動、空化效應及機械效應，使植物組織局部高溫、高壓，從而使植物細胞壁破碎而提高花青素的提取率[39]。李秀花等[40]研究發現超聲輔助提取法的提取率為85.69%，優于普通乙醇浸提法(61.64%)，在超聲輔助下的最佳提取條件為：乙醇濃度70%，料液比(m黑豆種皮∶V乙醇)1∶40 (g/mL)，提取時間30 min。溶劑也是影響提取率的重要因素，離子液體被認為是可代替乙醇作為超聲輔助提取天然產物的溶劑[41]。蘇適等[42]采用離子液體—超聲輔助法提取黑豆種皮花青素，提取率為4.118 mg/g，高于乙醇超聲輔助法。最佳提取參數為：離子液體濃度0.9 mol/L，料液比(m黑豆種皮∶V離子液體)1∶51 (g/mL)，提取溫度44 ℃，提取時間45 min。

3.4 純化工藝

黑豆種皮花青素粗提物中含有淀粉、蛋白質等雜質，對其進行純化處理可以提高黑豆種皮花青素的品質。大孔樹脂吸附法是一種被廣泛用于工業化生產天然色素，操作簡單、純化效果好的純化方法[43]。利用大孔吸附樹脂對黑豆種皮花青素粗提物進行純化處理，可有效去除粗提物中的雜質。朱學伸等[44]用AB-8型大孔樹脂吸附純化黑豆種皮花青素粗提物，最佳純化條件為粗提液上樣流速1.0 mL/min，吸附平衡時間4 h，60%的乙醇溶液作為洗脫液,洗脫流速1.5 mL/min，解析時間3 h。吳艷立等[45]篩選出DM301、ADS-17、HPD-417 3種不同型號的大孔樹脂兩兩組合，對黑豆種皮花青素粗提物進行純化，得到的最佳組合方法和純化條件為：DM301+HPD-417(mDM301∶mHPD-417=4∶1)的大孔樹脂組合濕法裝柱，粗提物以0.5 mL/min流速進行上樣，吸附飽和后，以pH 3.5、濃度為65%的乙醇溶液以1.5 mL/min流速進行洗脫。

3.5 改性工藝

黑豆種皮花青素的穩定性易受pH、光照、溫度、金屬離子、酶等因素的影響，使其應用受到限制。花青素的穩定性保護方法有：改變存儲環境、添加保護劑、添加輔助色素、金屬絡合、微膠囊化以及分子修飾等。目前分子修飾法是穩定性提升方法的研究熱點[46]，分子結構修飾的主要類型有：① 酰基修飾。經酰基修飾的花色苷可避免受到水的親核攻擊，使其不能轉變為無色的查耳酮或藍色的醌酮，從而保持溶液原有的顏色。張曉圓等[47]對黑豆種皮花色苷進行酰基修飾，酰化后對DPPH自由基的清除能力增強。② 酯基修飾。花色苷酯基修飾的轉化率高于酰基修飾。朱宏明等[48]對黑豆種皮花色苷進行酯基修飾，修飾后花色苷的自由基清除能力、體外抗氧化能力顯著提高。③ 吡喃化修飾。吡喃花色苷是花色苷與不飽和小分子物質發生加成或聚合反應后的產物，較花色苷更為穩定。花色苷的吡喃化修飾用時較長，但轉化率較高。何靜仁等[49]對多種吡喃花色苷在6個月貯藏期內的穩定性進行比較，發現穩定性順序為黃烷醇型>Vitisin A型>普通花色苷。

4 黑豆種皮花青素應用現狀

黑豆種植范圍廣泛、價格低廉，且黑豆種皮花青素具有安全無毒的特性，從黑豆種皮中提取花青素的方法較多、效果較好[50]，故現今黑豆種皮花青素已經在許多行業中得到了應用。

4.1 在食品行業的應用

黑豆種皮花青素有多種生理活性，而黑豆作為可直接食用的食物，成為了保健食品研究開發的熱點方向。中國確定的成人花青素日常攝入量為50 mg/d，可耐受最高攝入量尚未確定[51]。現在已經研發出了一些以黑豆種皮提取物為主要功能成分的保健食品，如一種生血養血的保健食品[52]以及一種用于護眼明目的保健食品[53]。在食品行業中，著色劑是應用極其廣泛的一類食品添加劑，天然著色劑更受消費者青睞。黑豆紅色素作為一種天然著色劑，具有較高的安全性和一定的營養價值，因此常應用于各類飲料、糕點、糖果等食品的著色[54]。此外，因黑豆種皮花青素安全無毒、抗菌能力強，其在食品防腐劑中的應用前景也將非常廣闊。

4.2 在醫藥行業的應用

黑豆種皮是常見的一味中藥材，主要用于治療虛熱、煩躁、血寒、風痹，含黑豆種皮的方劑有風引獨活湯、健脾湯等。隨著對黑豆種皮花青素生理活性研究的深入，黑豆種皮花青素相關藥物的研制也日益引起關注。現在已經研制出一些以黑豆皮為原料之一的藥物制劑用于治療肝硬化[55]及幽門螺旋桿菌引起的慢性胃炎[56]等。但目前對黑豆種皮花青素生理功能的開發利用程度還較低，例如對視力保護、神經保護、以及抗炎抑菌藥品的研發還較少，因此，在保證黑豆種皮花青素穩定性的條件下充分發揮其藥用功能，是醫藥研究者需面臨的重要挑戰。

4.3 在美容護膚行業的應用

隨著人們審美意識及對肌膚健康的重視提高，對護膚產品的需求越來越大，護膚品行業成為了快速發展的熱門行業。人們對于護膚的追求主要是抗氧化和抗衰老，黑豆種皮花青素具有較強的抗氧化活性，其清除DPPH自由基和羥自由基的能力均強于維生素C[18]，其抗氧化特性也可用于化妝品的防腐。目前面世的美白淡斑產品多以煙酰胺為主要成分，鑒于黑豆種皮花青素具有抑制酪氨酸酶活性作用，可預防黑色素沉著形成雀斑、黃褐斑等，含黑豆種皮花青素的淡化面部色斑的中藥面霜[57]為美白產品的研發提供了新思路。以黑豆種皮提取物為主要成分的保濕滋養面膜、黑豆精華液等美容產品也已經在市場上出售。如今消費者對護膚產品的需求大，追求安全、天然，研究者應把握機遇，積極研發以黑豆種皮花青素為主要成分的護膚產品。

5 展望

黑豆種皮中的花青素含量豐富，黑豆種皮花青素具有廣泛的生理功能、較高的安全性和易獲得性，所以對于黑豆種皮花青素的進一步開發和應用具有較高價值。但黑豆種皮花青素穩定性差，其活性易受到多種因素的影響，目前尚未有標準化的黑豆種皮花青素提取工藝，故如何提高黑豆種皮花青素的穩定性，保障其生理功能的有效發揮，是亟待解決的問題。此外，對黑豆種皮花青素在人體內的吸收、分布、代謝、排泄等影響其生物利用度的研究的缺乏，也是黑豆種皮花青素生理功能利用不足的原因之一。但黑豆種皮花青素發揮某些生理活性的作用機制尚未完全明確，大部分的生理活性也僅進行了體外研究以及試驗動物的研究，人體試驗及臨床研究較少，不同結構黑豆種皮花青素的生理活性及比較研究鮮見報道。因此，如何將黑豆種皮花青素應用于臨床也是需要解決的重要問題。總之，對黑豆種皮花青素進行更加深入的研究和產品研發，將有利于更好地利用黑豆種皮花青素，使其應用于更多行業，為促進人類健康作出貢獻。