藏藥獨一味抗類風濕關節炎的作用及其藥效物質基礎研究

張燕飛 陳瑞鑫 袁茂華 楊枝中 黃婷 陳素先 蔣運斌

摘 要 目的：研究藏藥獨一味抗類風濕關節炎（RA）的作用及其藥效物質基礎。方法：將56只SD大鼠隨機分為正常對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），模型組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），甲氨蝶呤組（陽性對照組，3 mg/kg），獨一味水提液低、中、高劑量組（0.5、1、2 g/kg，以生藥量計）和獨一味總黃酮組（200 mg/kg，以黃酮提取物計），每組8只。除正常對照組外，其余各組大鼠均于右后足墊注射弗氏完全佐劑（FCA）復制佐劑性關節炎模型。注射FCA次日，各組大鼠灌胃相應藥物，每天給藥1次（僅甲氨蝶呤組每3天給藥1次），連續給藥30天。給藥第15、30天時，分別測定大鼠左后足的足腫脹度，計算其關節炎指數。第30天給藥結束后，采用酶聯免疫吸附法測定各組大鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、 白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10水平，計算其胸腺指數、脾指數，并采用蘇木精-伊紅染色法觀察各組大鼠踝關節的病理學變化。結果：與正常對照組比較，模型組大鼠給藥第15、30天時的足腫脹度、關節炎指數以及給藥第30天時的脾指數和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P<0.01）;給藥第30天時的胸腺指數、IL-10水平均顯著降低（P<0.01）;踝關節可見明顯的滑膜細胞增生、浸潤關節腔等病理學改變。與模型組比較，各給藥組大鼠給藥第15、30天時的足腫脹度、關節炎指數以及給藥第30天時的脾指數和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低（P<0.01）;給藥第30天時的胸腺指數和血清中IL-10水平均顯著升高（P<0.01）;關節炎病理學變化明顯改善。與獨一味水提液高劑量組比較，獨一味總黃酮組大鼠給藥第15天時的足腫脹度以及給藥第15、30天時的關節炎指數、胸腺指數、脾指數、炎癥細胞因子水平、踝關節病理學變化等差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：藏藥獨一味具有良好的抗RA作用，總黃酮可能是其藥效物質基礎。

關鍵詞 獨一味;類風濕關節炎;佐劑性關節炎;藥效物質基礎;總黃酮;大鼠

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）05-0578-06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the effects and active ingredients of Tibetan medicine Lamiophlomis rotata? against rheumatoid arthritis （RA）. METHODS： Fifty-six SD rats were randomly divided into normal control group （0.5% sodium carboxymethylcellulose），model group （0.5% sodium carboxymethylcellulose）， methotrexate group （positive control group，3? ? ?mg/kg）， L. rotata water extract low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5，1， 2 g/kg，by crude drug）， L. rotata total flavonoid group （200 mg/kg，by flavonoid extat）， with 8 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given Freunds complete adjuvant （FCA） on the rats right hind footpad to induce adjuvant-induced arthritis model. The next day after injection of FCA， rats in all groups were given relevant medicine intragastrically， once a day （once every 3 days for methotrexate group） for 30 days. At 15th and 30th day of administration，the degree of paw swelling of left hind foot was measured， and the arthritis index， spleen index were calculated. At the end of 30th day of administration， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 in rat serum were determined by ELISA assay，the thymus index and spleen index were? calculated， the pathological changes of the ankle joints were observed by HE staining. RESULTS： Compared with normal control group，degree of paw swelling，arthritis index at 15th and 30th day of administration as well as the spleen index and the levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 in serum at 30th day of administration were significantly increased in model group （P<0.01）; while the thymus index and IL-10 level at 30th day of administration were significantly decreased（P<0.01）; synovial cell proliferation and infiltration of articular cavity were observed in ankle joint. Compared with model group，degree of paw swelling，arthritis index at 15th and 30th day of administration as well as the spleen index and the levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 in serum at 30th day of administration were significantly decreased in each medicine group （P<0.01）; while the thymus index and IL-10 level at 30th day of administration were significantly increased （P<0.01）;the pathological changes of arthritis were significantly improved. Compared with L. rotata water extract high-dose group， there were no significant differences in degree of paw swelling at 15th day of administration as well as the arthritis index，spleen index ，levels of inflammatory cytokines and pathological changes of ankle joint in L. rotata total flavonoid group （P>0.05）. CONCLUSIONS：Tibetan medicine L. rotata shows well anti-RA activity，and total flavonoids may be the active ingredients of its efficacy.

KEYWORDS? ?Lamiophlomis rotata; Rheumatoid arthritis; Adjuvant-induced arthritis; Active ingredients; Total flavonoids; Rat

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，病因尚不清楚，其發病機制可能與免疫紊亂、環境、遺傳易感等因素相關[1]，其特征是滑膜炎癥和增生、自身抗體產生（如類風濕因子和抗瓜氨酸化蛋白抗體）、軟骨和骨破壞以及全身性癥狀（包括心血管、肺、骨骼和心理疾病等）[2]。RA是一種慢性疾病，可造成患者生活質量、生理功能和心理功能等的下降，對個人和社會都造成了沉重負擔[3]。而研究顯示，中醫藥在改善RA癥狀、延緩RA骨破壞等方面發揮著重要作用[4]。

獨一味系藏族習用藥材，為唇形科植物獨一味Lamiophlomis rotata （Benth.） Kudo的干燥地上部分。2020年版《中國藥典》（一部）中記載，獨一味具有活血止血、祛風止痛的功效，用于跌打損傷、外傷出血、風濕痹痛等[5]。目前關于獨一味的研究主要集中在其活血止血的物質基礎及作用機制上[6-8]，而對其祛風止痛功效的研究較少。獨一味祛風止痛的功效主要用于治療風濕痹痛相關疾病，而風濕痹痛又是RA的典型特征[9]。王麗娟等[10]以足腫脹、關節炎指數、胸腺指數、腎上腺指數、足前列腺素含量為評價指標，證實了獨一味能明顯抑制佐劑性關節炎（AA）模型大鼠原發性和繼發性病變;臨床研究也表明，獨一味對RA患者具有較好的臨床療效和安全性[11]。但目前還未見基于中醫藥整體觀的獨一味抗RA的藥效物質基礎研究報道。本課題組前期采用網絡藥理學技術對獨一味抗RA的藥效物質基礎進行了預測，發現獨一味黃酮類成分可能是其潛在活性成分群[12]。鑒于此，本研究基于能體現RA發病機制的大鼠AA模型，以更豐富的評價指標對獨一味水提液和總黃酮的抗RA作用進行考察，為闡明獨一味抗RA的藥效物質基礎及其臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Elx800型酶標儀（美國Bio Tek公司）、DFC310 FX型生物顯微鏡（德國Leica公司）、MNT-150型游標卡尺（上海美耐特實業有限公司）、EL240型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）和Elix型超純水儀（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

獨一味藥材于2018年收集于青海玉樹縣，經重慶三峽醫藥高等專科學校藥學院馬羚副教授鑒定為唇形科植物獨一味L. rotata （Benth.） Kudo的干燥地上部分，藥材標本（編號duyiwei2018.12）保存于西南大學藥學院·中醫藥學院。弗氏完全佐劑（FCA，批號7027）購自美國Chondrex公司;甲氨蝶呤片（批號036190309，規格2.5 mg/片）購自上海上藥信誼藥廠有限公司;腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為TAE-569r、TAE-370r、TAE-385r、TAE-371r）均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號C0105S）購自上海碧云天生物技術有限公司;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自成都市科龍化工試劑廠;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康雄性SD大鼠，共56只，5～6周齡，體質量120～140 g，購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司[動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002）]。飼養期間大鼠自由進食和飲水，予自然光照。飼養室環境溫度為（22±2） ℃，相對濕度為40%～70%。大鼠適應性喂養4天后進行實驗。本實驗方案符合西南大學實驗動物倫理審查委員會對動物倫理的要求。

2 方法

2.1 獨一味水提液和總黃酮的制備

將獨一味藥材剪碎至0.5～2 cm長短，加5倍量（mL/g，下同）水浸泡1.5 h后，再加12倍量水煎煮提取1.5 h，過濾，收集濾液;濾渣再加12倍量水煎煮提取1.5 h，過濾，收集濾液。合并2次濾液，以80 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮至質量濃度為0.5 g/mL（以生藥量計），作為母液。以0.5%CMC-Na溶液稀釋母液，分別得到質量濃度為0.05、0.1、0.2 g/mL的獨一味水提液（以生藥量計），備用。

參考賈正平等[6]的方法制備獨一味總黃酮：取適量質量濃度為0.5 g/mL的獨一味水提液于燒杯中，加5倍體積水，充分攪拌后，上樣于已處理好的聚酰胺色譜柱;先以水洗脫至無色，然后用70%乙醇溶液洗脫色譜柱，并收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，即得獨一味總黃酮，得率為9.91%。根據2020年版《中國藥典》（一部）獨一味片中總黃酮含量測定方法[5]進行測定，結果所制獨一味總黃酮樣品的純度以蘆丁計為63.86%。

2.2 分組、造模與給藥

將56只大鼠隨機分為正常對照組，模型組，甲氨蝶呤組（陽性對照組），獨一味水提液低、中、高劑量組和獨一味總黃酮組，每組8只。造模前先用游標卡尺測定各組大鼠的左后足掌厚度，記為第0天的足掌厚度。除正常對照組外，其余各組大鼠均于右后足墊注射FCA 0.05 mL復制AA模型[13];正常對照組大鼠注射等體積生理鹽水。注射FCA次日，陽性對照組大鼠灌胃甲氨蝶呤（3 mg/kg[14]，以0.5%CMC-Na溶液為溶劑制成混懸液）;獨一味水提液低、中、高劑量組大鼠分別灌胃獨一味水提液[0.5、1、2 g/kg（以生藥量計），劑量參考2020年版《中國藥典》（一部）中獨一味片的臨床使用劑量進行換算后制定[5]];獨一味總黃酮組大鼠灌胃總黃酮提取物（200 mg/kg，以0.5%CMC-Na溶液為溶劑制成混懸液，劑量相當于獨一味水提液高劑量組中黃酮類成分的量）;正常對照組和模型組大鼠灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。僅甲氨蝶呤組大鼠每3天給藥1次，其余各組大鼠均每天給藥1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續給藥30天。

2.3 大鼠一般情況觀察

給藥第15天時，觀察各組大鼠的精神、活動狀態和飲食、體毛色澤及關節紅腫情況，并測定其體質量。根據大鼠未注射FCA的另外3只肢體的關節紅腫情況判斷是否造模成功[15]。

2.4 大鼠足腫脹度的測定

分別于第15、30天給藥4 h后，采用游標卡尺測定各組大鼠左后足掌的厚度（mm），并計算其足腫脹度（足腫脹度=第15天或第30天的左后足掌厚度/第0天的左后足掌厚度）。

2.5 大鼠關節炎指數的測定

第15、30天給藥4 h后，按5級評分法對大鼠未注射FCA的其余3只肢體的病變程度進行評分[15]：無紅腫，0分;足小趾關節紅腫，1分;趾關節和足趾均腫脹，2分;踝關節以下的足爪均腫脹，3分;包括踝關節在內的全部足爪紅腫，4分。3只肢體評分之和即為關節炎指數。

2.6 大鼠炎癥細胞因子水平的測定

第30天給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，測定大鼠體質量，觀察大鼠左后足掌腫脹情況并拍照。然后腹腔注射3.5%水合氯醛（10 mL/kg）將大鼠麻醉，腹主動脈采血，在4 ℃下放置過夜，然后在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上層血清。按相應ELISA檢測試劑盒說明書方法操作，分別檢測血清中致炎細胞因子（TNF-α、IL-? ? 1β、IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的水平。

2.7 大鼠胸腺指數和脾指數的測定

大鼠腹主動脈采血后，立即剝離其胸腺和脾臟，用濾紙輕輕擦拭干凈，稱質量，計算胸腺指數和脾指數：胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g）;脾指數=脾質量（mg）/體質量（g）。

2.8 大鼠踝關節病理學變化的觀察

取大鼠左踝關節，以4%多聚甲醛固定，再經過脫鈣、脫水、常規石蠟包埋、切片（厚度4～5 μm），行常規HE染色后，在顯微鏡下觀察大鼠踝關節的病理學變化（包括炎癥反應、滑膜增生、軟骨破壞等）。

2.9 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，同組間不同給藥時間的比較采用配對t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊者組間兩兩比較采用Dunnetts T3法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠一般情況的影響

給藥第15天時，與正常對照組比較，模型組大鼠表現出精神倦怠、活動減少、食欲下降、被毛失去光澤、體質量減輕等癥狀，且未注射FCA的其余3只肢體均出現不同程度的關節紅腫，表明造模成功。上述現象在各給藥組大鼠中均有所改善。

3.2 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠足腫脹度的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠給藥第15、30天時的足腫脹度均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥大鼠給藥第15、30天時的足腫脹度均顯著降低（P<0.01）。與同組給藥第15天時比較，各給藥組大鼠給藥第30天時的足腫脹度均顯著降低（P<0.01），而模型組差異無統計學意義（P>0.05）。與獨一味水提液高劑量組比較，獨一味總黃酮組大鼠給藥第15天時的足腫脹度差異無統計學意義（P>0.05），但給藥第30天時的足腫脹度顯著升高（P<0.05）。給藥第15、30天時各組大鼠的足腫脹度測定結果見表1。

3.3 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠關節炎指數的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠給藥第15、30天時的關節炎指數均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠給藥第15、30天時的關節炎指數均顯著降低（P<0.01）。與同組給藥第15天時比較，各給藥組大鼠給藥第30天時的關節炎指數均顯著降低（P<0.05或P<0.01），而模型組差異無統計學意義（P>0.05）。與獨一味水提液高劑量組比較，獨一味總黃酮組大鼠給藥第15、30天時的關節炎指數差異均無統計學意義（P>0.05）。給藥第30天時各組大鼠的左后足掌見圖1，給藥第15、30天時各組大鼠的關節炎指數測定結果見表2。

3.4 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P<0.01），IL-10水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低（P<0.01），IL-10水平均顯著升高（P<0.01）。各組大鼠血清中TNF-α、 IL-1β、IL-6和IL-10水平測定結果見表3。

3.5 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠胸腺指數、脾指數的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胸腺指數顯著降低（P<0.01），脾指數顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠的胸腺指數均顯著升高（P<0.01），脾指數均顯著降低（P<0.01）。各組大鼠胸腺指數、脾指數測定結果見表4。

3.6 獨一味水提液和總黃酮對AA模型大鼠踝關節病理學變化的影響

正常對照組大鼠踝關節滑膜細胞結構完整、排列整齊，細胞下為疏松結締組織，無炎癥細胞浸潤。與正常對照組比較，模型組大鼠踝關節組織可見明顯的滑膜細胞增生、浸潤關節腔，滑膜細胞下的結締組織因膠原纖維增生而變得緊密，間質可見明顯的炎癥細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均不同程度地好轉，滑膜細胞向關節腔的浸潤、間質的炎癥細胞浸潤均不同程度地減輕。各組大鼠踝關節病理學變化顯微圖見圖2。

4 討論

AA是一種經典的免疫炎癥模型，其發病機制和病理表現與人體RA相似，目前已被廣泛用于抗RA藥物研發的基礎研究中[16-17]。甲氨蝶呤是在臨床上用于治療RA的首選藥物之一，其在開發治療RA藥物的基礎研究中常被用作陽性藥物[13，18]。故本研究以甲氨蝶呤為陽性對照藥物，采用AA大鼠模型來研究獨一味水提液和總黃酮的抗RA作用。在RA中，致炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的不平衡會誘導自身免疫、慢性炎癥的發生，并由此引起關節損傷[19]。TNF-α、IL-1β、IL-6是常見的致炎細胞因子，IL-10是常見的抗炎細胞因子，這些細胞因子廣泛參與了RA的發病進程[19-20]。相關研究發現，在RA患者的血清中TNF-α水平顯著升高，其與RA患者的炎癥和關節破壞直接相關[21]。TNF-α可通過多方面因素介導RA的發生與發展，如刺激B淋巴細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞的增殖和分化，誘導產生其他促炎細胞因子（如IL-1、IL-6），促進滑膜細胞上調溶血素、膠原酶、前列腺素、粒細胞單核細胞集落刺激因子的分泌，通過成纖維細胞刺激黏附分子（如細胞內黏附分子1）的表達等[22]。IL-1β可通過增加滑膜成纖維細胞的細胞因子、趨化因子、誘導型一氧化氮合酶等的釋放，介導RA的發生與發展[23];IL-6可通過作用于嗜中性粒細胞而引起炎癥和關節的破壞，從而參與到RA的發生與發展中[24]。而IL-10可通過多個途徑阻滯RA的發生與發展，如減少TNF-α、IL-1β、IL-6的形成和抑制TNF-α誘導的滑膜成纖維細胞產生前列腺素等[25]。因此，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高IL-10的水平，對阻滯RA的發生與發展至關重要。

胸腺、脾是機體中非常重要的免疫器官。其中，胸腺主要參與細胞免疫，脾主要參與體液免疫，胸腺質量和脾質量與免疫細胞數量及免疫功能直接相關，故胸腺指數、脾指數可在一定程度上反映機體的免疫功能狀態[26]。而RA是一種自身免疫性疾病，發病后可使機體的胸腺指數、脾指數偏離正常狀態[27]。

本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠的足腫脹度、關節炎指數、脾指數以及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，胸腺指數和血清中IL-10水平均顯著降低，踝關節組織可見明顯的病理學改變（如炎癥反應、滑膜增生等），均提示造模成功。與模型組比較，甲氨蝶呤組和獨一味各給藥組大鼠的足腫脹度、關節炎指數、胸腺指數、脾指數、炎癥細胞因子水平、踝關節病理學變化等均顯著改善;且通過各給藥組大鼠給藥第15、30天時的足腫脹度、關節炎指數的比較可以發現，各給藥組大鼠上述指標水平均隨著給藥時間的延長而顯著降低，而模型組大鼠的上述指標水平并未隨著實驗時間的推移發生顯著變化。綜合以上結果可知，獨一味水提液、總黃酮均具有良好的抗RA的作用。進一步通過與獨一味水提液高劑量組比較發現，獨一味總黃酮組大鼠在給藥第15天時的足腫脹度以及在給藥第15、30天時的關節炎指數、胸腺指數、脾指數、炎癥細胞因子水平、踝關節病理學變化等差異均不顯著。以上結果提示，總黃酮可能是獨一味抗RA的主要藥效成分群，這與本課題組前期基于網絡藥理學的獨一味抗RA的藥效物質基礎預測結果一致[12]。

綜上，藏藥獨一味具有良好的抗RA作用，總黃酮可能是其藥效物質基礎。但其確切的藥效物質基礎及其作用機制等尚需進一步研究。

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（收稿日期：2020-10-29 修回日期：2021-01-26）

（編輯：林 靜）