靈芝抑制腫瘤微環境中Treg細胞功能的機制

李 芳， 余夢瑤， 江 南， 賀黎銘， 姚 珂， 羅 霞

(四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所， 菌類藥材系統研究與開發實驗室， 中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室， 成都 610041)

1 引 言

靈芝是我國傳統的補益中藥，具有扶正固本的作用，現代藥理研究表明靈芝具有抑制腫瘤[1]和免疫調節作用[2]，近年來常被用于腫瘤放化療的輔助治療.靈芝多糖和三萜是其主要藥效成分，多糖對體外培養的腫瘤細胞無直接抑制作用，其抑瘤作用與免疫調節密切相關：促進樹突細胞成熟和分化[3]，增強巨噬細胞的吞噬功能[4]，促進自然殺傷細胞活性[5]等；而靈芝三萜類成分主要通過直接毒殺腫瘤細胞而發揮抗腫瘤作用[6]，二者抗腫瘤作用沒有直接的可比性，但適宜的配伍能有效提高抗腫瘤作用[7].

調節性T細胞(Treg細胞)是以CD4+CD25+FOXP3+為特征的T淋巴細胞亞群，是體內重要的免疫負調控細胞，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素[8].研究發現靈芝孢子多糖能有效抑制Treg細胞功能.但是靈芝子實體三萜、多糖配伍是否能有效提高對Treg細胞功能的抑制作用，目前尚無相關的研究報道.本研究利用前期研究獲得的最佳抑瘤配伍劑量[7]，開展該方面的深入研究，有利于進一步闡釋靈芝抗腫瘤的作用機制.

2 材料與方法

2.1 主要試劑

二甲亞砜(DMSO)、透明質酸酶、DNA酶Ⅰ、膠原酶Ⅳ、牛血清白蛋白(BSA)，購自sigma公司.小鼠腫瘤浸潤組織淋巴細胞分離液購自上海研謹生物科技有限公司.CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC、foxp3-PE流式抗體購自BD生物科技公司.Foxp3染色固定透膜液購自invitrogen公司.UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購自生工生物工程股份有限公司.瓊脂糖B、4S Red Plus 核酸染色劑、2X SG Fast qPCR Master Mix購自BBI公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、反轉錄試劑盒，購自Thermo Scientific公司.ELISA試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；兔抗FOXP3多克隆抗體購自美國R&D公司.多聚甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司.蘇木素購自北京百靈威科技有限公司.中性樹膠購自中國上海懿洋儀器有限公司.其余常用化學試劑購自成都科龍化工試劑廠.

2.2 方 法

2.2.1 實驗動物造模和分組 Km(昆明種)小鼠，SPF級，雄性，體重18～22 g，由四川省中醫藥科學院動物中心提供，動物生產證號：SCXK(川)2013-19，飼養于SPF級動物房.靈芝多糖和三萜從赤芝子實體中提取獲得.H22細胞株購自中科院細胞所，于小鼠腹腔內傳代保存.每只小鼠右側腋窩皮下準確接種H22細胞 2×106個，接種次日，小鼠隨機分成對照組、三萜組、多糖組和配伍組，每組20只，分別以溶劑、靈芝三萜(90 mg/kg)、多糖(43 mg/kg)及多糖三萜(90 mg/kg+43 mg/kg)配伍腹腔注射給藥，連續給藥15 d，從第3 d起每2 d檢測一次腫瘤直徑，末次給藥結束后頸椎脫臼處死小鼠，分離腋下腫瘤稱重，計算抑瘤率和體積(0.52×長×寬2)，繪制腫瘤生長曲線.

2.2.2 靈芝多糖和三萜的提取 按照《中國藥典2015版》中靈芝多糖和三萜提取和含量測定方法操作[9]，采用Sevag法除去提取物中的蛋白質后對靈芝多糖和三萜含量進行測定。

2.2.3 流式細胞術檢測Treg細胞數量 解剖小鼠腫瘤組織，用RPMI1640培養基洗去血污.稱取1 g左右的腫瘤組織，加入4 mL酶解液，用眼科剪剪碎至2～5 mm3大小，置37 ℃酶解2 h.取酶解液，以200目不銹鋼網過濾，除去未酶解完全的組織塊.取玻璃試管，加入5 mL小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞分離液，離心后獲得淋巴細胞.洗滌淋巴細胞兩次后加入CD3、CD4、CD25抗體室溫避光孵育30 min后離心5 min，棄上清.加入1 mL染色緩沖液，重懸細胞，400～600 g離心5 min，棄上清.完成表面抗原染色后的細胞，再加入1 mL Foxp3染色固定透膜液，室溫孵育1 h.加入透膜緩沖液重懸細胞，離心后棄上清，加入FOXP3抗體染色后上流式細胞儀檢測.

2.2.4 熒光定量PCR檢測mRNA水平 按15～25 mg小鼠腫瘤組織加入0.5 mL Trizol用勻漿器勻漿處理，獲得的勻漿液按柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒操作步驟進行總RNA提取，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA.PCR反應體系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 7.2 μL.PCR循環條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環.為保證結果的精確性，重復三次每個反應.

引物序列:

GAPDH-F：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，

GAPDH-R：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；

CCL22-F：5′-TCTCGTCCTTCTTGCTGTGG-3′，

CCL22-R：5′-GCAGAGGGTGACGGATGTAGT-3′；

CCR4-F：5′-CATCTCGGATTTGCTGTTCG-3′，

CCR4-R：5′-CTGGTGATGACGCCATAGGT-3′；

FOXP3-F：5′-TGGTTTACTCGCATGTTCGC-3′，

FOXP3-R:5′-AACTCAAATTCATCTACGGTCCA-3′.

2.2.5 ELISA法檢測細胞因子含量 將小鼠腫瘤組織研磨成細胞懸液，離心后取上清，然后按試劑盒說明書進行具體操作.用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度.

2.2.6 免疫組化染色法檢測腫瘤組織中FOXP3蛋白的表達 處死小鼠，解剖下腫瘤組織，放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，制備組織切片.脫蠟后的切片放入染色缸，3%甲醇雙氧水室溫10 min；PBS洗3次，每次5 min；將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，反復1次，冷卻后，PBS洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗，4 ℃過夜；滴加生物素化二抗，37 ℃30 min；PBS水洗3次，每次5 min；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，混勻試劑后滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反映時間2 min，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片.采用顯微成像系統拍照后，以Image pro plus6.0軟件對陽性表達區域進行累積光密度(IOD)分析.

3 結果與分析

3.1 靈芝多糖和三萜的含量測定

3.1.1 靈芝多糖含量 按中國藥典中硫酸蒽酮法檢測，靈芝多糖標準曲線測定結果如下：

圖1 多糖標準曲線Fig.1 Polysaccharide standard curve

根據樣品吸光度由公式y=8.6905x+0.2176計算出提取物樣品中多糖含量為481.90 mg/g.

3.1.2 靈芝三萜含量 按中國藥典中方法檢測，靈芝三萜標準曲線測定結果如下：

根據樣品吸光度由公式y=12.634x+0.0106計算出提取物中三萜含量為434.40 mg/g.

圖2 三萜標準曲線Fig.2 Triterpene standard curve

3.2 H22荷瘤小鼠瘤體生長情況

小鼠處死后立即解剖下腫瘤組織，稱重，各組小鼠瘤重及腫瘤體積分別見表1和圖3.與對照組相比，各給藥組解剖下的小鼠瘤重都明顯更輕，其中靈芝多糖組具有顯著性差異(P<0.05)，配伍組具有極顯著性差異(P<0.01)；配伍組抑瘤率明顯高于多糖組和三萜組，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01).各給藥組腫瘤體積均較對照組減小(P<0.05，P<0.01)，配伍組腫瘤體積明顯小于多糖組和三萜組，差異具有統計學意義(圖 1，P<0.05，P<0.01).表明靈芝多糖和三萜均能抑制小鼠H22瘤體生長，二者配伍給藥能增強抑瘤作用.

表1 小鼠瘤體重量及抑瘤率

圖3 腫瘤生長曲線圖

3.3 靈芝對小鼠腫瘤微環境中Treg細胞數量的影響

經流式細胞法測定小鼠腫瘤組織中Treg細胞(CD4+CD25+foxp3+)在CD4+細胞中的比例，統計結果如表 2所示，流式結果圖見圖4.與對照組相比，各給藥組小鼠腫瘤微環境中Treg細胞比例均有所降低，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；配伍組Treg細胞比例明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統計學意義(P<0.05).結果表明，靈芝多糖和三萜均能降低腫瘤微環境中Treg細胞比例，二者配伍給藥具有協同效應.

表2 小鼠腫瘤微環境中Treg細胞比例

3.4 Treg細胞趨化相關關鍵基因的RT-PCR檢測

經檢測小鼠腫瘤微環境中Treg 細胞趨化相關關鍵基因：趨化因子CCL22及其受體CCR4和FOXP3在腫瘤組織中的表達，結果如圖5所示.與對照組相比，靈芝三萜組和多糖組中相關基因的表達無明顯變化，配伍組相關基因的表達明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，配伍組的CCL22、CCR4和FOXP3基因表達水平都明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統計學意義(P<0.01).結果表明，靈芝三萜、多糖配伍給藥能降低Treg 細胞趨化相關關鍵基因的表達，減少Treg細胞向腫瘤微環境中趨化.

圖4 小鼠腫瘤微環境中Treg細胞比例流式圖Fig.4 FACS analyses of Treg cell ratio in mouse tumor microenvironment

圖5 腫瘤微環境中基因表達分析圖

3.5 腫瘤微環境中細胞因子水平

經檢測腫瘤組織中細胞因子IL-10、TGF-β1和IL-2含量，統計結果如圖6所示.與對照組相比，各給藥組的IL-10和TGF-β1的含量均有所降低，其中多糖組和配伍組差異具有統計學意義(P<0.05)；配伍組IL-10和TGF-β1水平明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統計學意義(P<0.05).與對照組相比，各給藥組的IL-2的含量均有所降低，多糖組和配伍組差異具有統計學意義，配伍組IL-2水平明顯高于三萜組和多糖組(P<0.05).結果表明，靈芝三萜和多糖均能降低IL-10和TGF-β1水平，同時增加IL-2水平.

圖6 小鼠腫瘤組織中細胞因子含量

3.6 腫瘤微環境中FOXP3蛋白表達水平

各組腫瘤組織中FOXP3陰性細胞呈藍色，底物呈白色，陽性細胞呈黃色或棕黃色，FOXP3陽性產物主要分布在細胞核、細胞質及細胞間質.與對照組相比，各給藥組FOXP3均呈現較弱的表達水平(圖7).

圖7 小鼠腫瘤微環境中FOXP3蛋白表達Fig.7 Expression of FOXP3 protein in mouse tumor microenvironment

平均光密度統計結果(表 3)顯示，與對照組相比，各給藥組小鼠腫瘤組織FOXP3蛋白含量均有降低，其中三萜組和配伍組差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；配伍組小鼠腫瘤組織FOXP3蛋白含量明顯低于三萜組和多糖組，其中多糖組與配伍組差異具有統計學意義(P<0.05).結果表明，靈芝三萜和多糖均能降低小鼠腫瘤組織中FOXP3蛋白的表達，二者配伍給藥具有協同效果.

表3 小鼠腫瘤組織FoxP3平均光密度統計結果

靈芝多糖類制劑近年來常被用于臨床腫瘤患者放化療的輔助治療，在提高患者對放化療的耐受性、增強免疫、減輕副反應等方面的效果都已被臨床初步證實[10-11]，而靈芝三萜類成分目前尚無臨床應用報道.靈芝多糖、三萜配伍使用能顯著提高抑瘤效果，目前已在動物實驗得到證實[12]，在獲得靈芝多糖、三萜抗腫瘤最佳配伍劑量的基礎上，開展二者配伍使用的內在機制研究，可為靈芝輔助治療腫瘤提供理論依據與指導.

腫瘤微環境(TME)是支持腫瘤產生、生長和轉移的復雜腫瘤生態系統，包含腫瘤細胞、成纖維細胞、免疫細胞、細胞間質、微血管以及浸潤其中的生物分子[13].近年在TME中發現了新的靶點，可以幫助指導和改善各種癌癥治療的作用，特別是通過增強宿主抗腫瘤免疫反應而起作用的免疫療法[14]，是近年免疫治療研究熱點.Treg細胞是腫瘤微環境中一類免疫負調控細胞，主要是CD4+CD25+FOXP3+細胞，原本在胸腺、骨髓、淋巴結以及外周血中自然產生，經趨化因子CCL22與其受體CCR4的結合，將其趨化至腫瘤微環境中[15].Treg細胞能夠直接接觸抑制靶細胞活性，通過分泌IL-10及TGF-β等細胞因子抑制Th細胞的增殖分化及其分泌細胞因子，抑制效應細胞的免疫應答，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素[16].

Sun等[17]的體外實驗研究發現，靈芝孢子多糖可使B16F10黑素瘤細胞培養液中的IL-10及TGF-β生成顯著減少，有效抑制Treg細胞活性.Li等[18]研究表明，靈芝多糖能顯著抑制肝癌小鼠腫瘤生長，抑制腫瘤微環境中FOXP3的表達，減少Treg細胞向腫瘤組織中募集，消除Treg 細胞的免疫抑制，使腫瘤微環境中免疫平衡偏向效應性T細胞.本研究發現靈芝子實體多糖同樣能減少IL-10、TGF-β生成及FOXP3的表達，Treg細胞向腫瘤組織中募集，三萜本身無此作用，但通過三萜、多糖配伍使用后作用效果增強，因此，三萜能協同增強多糖對腫瘤微環境中Treg細胞功能抑制效應.

靈芝三萜能快速增強機體抗腫瘤免疫活性，促進肺癌小鼠機體產生白介素-2(IL-2)，并提高自然殺傷(NK)細胞的免疫活性[19].Treg細胞主要表面抗原CD25，是白介素2受體α鏈(IL-2Rα)，能競爭性與IL-2結合，使腫瘤微環境中效應T細胞因為缺乏IL-2受到抑制[20].本研究發現靈芝三萜及配伍均提高了腫瘤微環境中IL-2水平，三萜可能通過增加IL-2的分泌或解除Treg細胞引起的IL-2競爭，對多糖抑制Treg細胞功效起到協同作用.

綜上所述，本研究從腫瘤微環境中Treg細胞數量、特異蛋白表達、趨化因子mRNA水平及細胞因子水平等方面分別考察靈芝多糖、三萜對Treg細胞功能的影響研究，確認了靈芝三萜、多糖對腫瘤微環境中Treg細胞功能的抑制作用，有利于促進機體抗腫瘤免疫.