甘藍型油菜BnbHLH122基因的克隆、表達模式及脅迫響應分析

唐佳佳， 萬云寶， 王茂林

(四川大學生命科學學院 生物資源與環境教育部重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)是我國種植面積最廣的油菜類型，可用于生產食用油、生物柴油和動物飼料等，有著很高的經濟價值[1].然而，甘藍型油菜的產量和品質常常受到極端溫度、高鹽、干旱等非生物脅迫的影響，因此，培育具有較強抗逆性的甘藍型油菜新品種已然成為了農業生產的當務之急[2].相關研究表明，植物轉錄因子(Transcription factors, TFs)可與環境脅迫應答基因的啟動子區的順式作用元件相互作用，并通過元件調節應答基因的表達水平，從而增強植物機體對環境脅迫的耐受力[3].

植物bHLH(basic Helix-Loop-Helix)轉錄因子是植物體內必不可少的轉錄因子家族成員之一，能夠參與調控植物的生長發育、脅迫響應等過程[4].在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，SPATULA基因參與調控花器官的發育和種子的萌發過程[5-6]；PIF3基因能夠負向調控植物的光的形態建成[7]；AtbHLH92基因的過表達能在一定程度上增強轉基因植株對高鹽和甘露醇的耐受性[8].在煙草(Nicotianabenthamiana)中，NbbHLH1和NbbHLH2基因正向調控由茉莉酸誘導的尼古丁的合成[9]；NtbHLH123基因能夠參與調控植物冷應激反應[10].在水稻(Oryzasativa)中，OsbHLH148基因所編碼的蛋白能夠與OsJAZ蛋白相互作用，從而調控水稻的耐旱性[11].除此之外，人們還發現辣椒中的CabHLH94基因在青枯菌對辣椒的侵染過程中起正向調節作用[12].

綜上所述，植物bHLH轉錄因子家族參與調節植物體內的多項生理生化反應是植物體內重要的調控因子.但是，目前對于植物bHLH轉錄因子家族的功能研究還十分局限，大部分研究工作都還停留在擬南芥、煙草、水稻等模式植物中.本研究對甘藍型油菜bHLH122轉錄因子基因進行了克隆、表達模式和脅迫響應分析，為進一步闡明甘藍型油菜中該轉錄因子的作用和有效利用bHLH轉錄因子家族成員培育抗逆性油菜新品種奠定基礎.

2 材料與方法

2.1 材 料

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)科樂油1號和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，由本實驗提供，種植在25 ℃的植物光照培養室內(光照/黑暗=16 h/8 h).

2.2 方 法

2.2.1 甘藍型油菜總RNA的提取與cDNA的合成 利用植物總RNA提取試劑盒(購自成都福際公司)提取甘藍型油菜的總RNA，具體操作步驟詳見試劑盒說明書.然后以檢測合格的RNA為模板，按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒(購自北京全式金公司)操作步驟合成cDNA.

2.2.2BnbHLH122基因編碼區全長的克隆 根據NCBI甘藍型油菜數據庫中所預測的bHLH122轉錄因子基因序列，設計特異性引物(見表1)，然后采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(購自南京喏維贊)擴增其編碼區全長序列，擴增體系為50 μL，擴增程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34個循環，72 ℃后延伸5 min.PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用北京天根的膠回收試劑盒進行純化回收，回收產物再連接到pESAY?-Blunt克隆載體上，轉化進Trans1-T1感受態細胞，菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養，結合藍白班篩選和菌落PCR鑒定結果，挑選出陽性單菌落擴大培養并采用質粒小提試劑盒(購自北京天根生物公司)提取質粒，最后將質粒送往華大基因有限公司進行測序.

2.2.3BnbHLH122基因的生物信息學分析 利用DNAMAN軟件對測序所得的基因序列進行序列比對；采用ExPASY在線分析系統里的ProtParam(https://web.expasy.org)工具預測蛋白質的理化性質；使用在線工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)對BnbHLH122基因所編碼的蛋白進行三級結構預測；利用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹.

表1 PCR擴增引物序列

2.2.4 亞細胞定位分析和轉錄激活活性驗證 首先根據BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因的CDS區分別設計出帶有特異性酶切位點的引物，引物序列見表2和表3(下劃線標示酶切位點).然后以2.2.2所得的測序正確的陽性克隆質粒為模板，參照2.2.2中的方法對目的基因(不包含終止子)進行PCR擴增和純化回收.再用T4連接酶將雙酶切后的目的片段與pBI221-EGFP、pGBKT7載體質粒分別連接起來.再轉化進Trans5α感受態細胞，在含有抗生素(氨芐霉素/卡那霉素)的LB平板上進行篩選.菌落PCR鑒定和質粒測序后，①亞細胞定位：利用PEG介導的煙草原生質體瞬時表達法將測序正確的重組質粒分別轉化進煙草葉片原生質體，并以pBI221-EGFP空質粒為對照組，經22 ℃暗培養16 h后，在顯微鏡下觀察原生質體；②轉錄激活活性驗證：利用LiAc介導的酵母細胞轉化法將pGBKT7-BnbHLH122-1和pGADT7、pGBKT7-BnbHLH122-2和pGADT7、pGBKT7和pGADT7(對照組)三組混合質粒分別共轉化進酵母感受態細胞中，再將菌液分別劃線在二缺SD/-Leu/-Trp和四缺SD/-Leu/-Trp/-His平板上，倒置于30 ℃培養箱中暗培養3～7 d后，拍照保存.

表2 亞細胞定位引物

表3 轉錄激活活性驗證引物

2.2.5BnbHLH122基因的時空表達模式分析 將科樂油一號油菜置于25 ℃，光照16 h∶黑暗8 h條件下培養，分別采集油菜苗期、抽薹期以及花期的根、莖、葉與花速凍于液氮中，每3株油菜為1個樣品池，不同時期不同組織各取3個重復樣品池.分別提取各個樣品的RNA，并反轉錄成cDNA，以其為模板進行qRT-PCR分析BnbHLH122基因的時空表達模式.定量引物見表4，內參基因為甘藍型油菜β-actin基因(GenBank登錄號：AF111812).按照TransScript?Tip Green qPCR Super Mix(購自北京全式金公司)使用說明書，設計反應體系為：20 μL，其中模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransStart?Tip Green qPCR Super Mix 10 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL．反應程序采用三步法：94 ℃預變性30 s，40個循環(94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s)，同時繪制溶解曲線(從65 ℃上升至95 ℃，每個循環上升0.5 ℃).實驗設有3次技術重復，并且最終結果采用2-△△Ct法計算基因表達量，GraphPad Prism7作圖.

表4 熒光定量引物

2.2.6BnbHLH122基因在逆境脅迫和激素處理下的基因表達分析 種植于土壤中的甘藍型油菜，待其長至四葉一心期時，參照王靜等人[13]的處理方法，選取長勢相同的植株分別進行以下處理：①非生物脅迫：將植株分別放在4 ℃和40 ℃的光照培養箱(日照16 h∶黑暗8 h)中進行冷脅迫處理和熱脅迫處理，然后每間隔2 h進行一次取樣；滲透、鹽以及干旱的處理是將植株清洗干凈后，轉移至1/2×Hogland營養液中緩苗3 d，然后把油菜分別放在含有200 mmol/L甘露醇、200 mmol/L NaCl和20% PEG6000的1/2×Hogland營養液中進行處理，再在0、3、6、9、12、24、48 h時各取一次樣.②核盤菌脅迫：將直徑為6 mm的帶有核盤菌(購自北納生物公司，菌種編號為BNCC 122299)菌絲的菌塊接種在油菜葉片上，套上塑料袋保持濕度，然后在0、6、9、12、24、48、72 h時各取一次樣.③激素處理：將植株轉移至1/2×Hogland 營養液中緩苗3 d，然后把油菜分別放入含有0.05%無水乙醇和0.01% Tween-20的100 μmol/L ABA、SA以及MeJA激素的1/2×Hogland營養液中進行處理，再在0、3、6、9、12、24 h時各取一次樣.以上所有處理均設置三次獨立重復試驗.將采集的所有樣品分別進行RNA提取并合成cDNA后，參考2.2.5進行qRT-PCR定量分析.

2.2.7BnbHLH122基因的啟動子分析 在NCBI上查找到BnbHLH122參考基因上游約2 000 bp左右的DNA序列，將其載入PlantCARE在線軟件中進行分析.

3 結果與分析

3.1 BnbHLH122基因編碼區克隆和序列比對

采用同源克隆技術，以甘藍型油菜cDNA為模板進行PCR擴增，得到兩條不同的基因序列，分別命名為BnbHLH122-1(GenBank登錄號：MT795160)和BnbHLH122-2(GenBank登錄號：MT795161).BnbHLH122-1的CDS區全長為1 086 bp，共計編碼361個氨基酸，BnbHLH122-2的CDS區全長為1 095 bp，共計編碼364個氨基酸.這兩個基因的CDS序列的相似性為96.57%，氨基酸序列的相似度為97.53%.與甘藍型油菜參考基因組數據庫中預測的2個參考基因相比，BnbHLH122-2與LOC106435350所編碼的氨基酸序列一致，BnbHLH122-1與LOC106346071的氨基酸序列的相似度為98.08%.與擬南芥AtbHLH122基因相比，BnbHLH122-1、BnbHLH122-2與擬南芥AtbHLH122基因所編碼的氨基酸序列相似度分別為79.95%、81.51%，氨基酸序列比對結果見圖1.

圖1 氨基酸序列比對 注：“.”表示缺失位點.Fig.1 Alignment ofamino acid sequences Note:“.” Represents the missing site.

3.2 BnbHLH122蛋白質理化性質分析和三級結構預測

3.2.1 BnbHLH122蛋白質理化性質分析 利用Protparam工具對兩個甘藍型油菜BnbHLH122基因所編碼的蛋白質的理化性質進行分析，結果如表5所示，兩個基因所編碼的蛋白的不穩定系數均高達60多，均為不穩定蛋白質.兩個BnbHLH122基因所編碼的蛋白質的總平均親水性(GRAVY)分別為-0.694、-0.684，均為親水性蛋白質.

表5 BnbHLH122蛋白的理化性質

3.2.2 BnbHLH122蛋白質的三級結構預測 利用SWISS-MODEL在線分析平臺構建BnbHLH122蛋白和AtbHLH122蛋白的三級結構模型，結果發現兩個BnbHLH122蛋白同AtbHLH122蛋白的三級結構均含有bHLH轉錄因子家族中的典型的螺旋-環-螺旋結構，進一步表明兩個BnbHLH122蛋白屬于bHLH轉錄因子家族，但三者空間結構并不完全相同，存在一定差異.

3.3 BnbHLH122蛋白系統進化樹分析

系統進化樹結果表明(見圖2)，BnbHLH122-1蛋白與白菜(Brassicarapa)中的bHLH122轉錄因子高度同源，BnbHLH122-2蛋白則與甘藍(Brassicaoleracea)中的bHLH122轉錄因子高度同源.眾所周知，甘藍型油菜(AACC，n=19)是白菜(AA，n=10)和甘藍(CC，n=9)自然雜交加倍而成，因此我們推測BnbHLH122-1位于A組染色體，來源于白菜，而BnbHLH122-2位于C組染色體，來源于甘藍.進化樹中BnbHLH122蛋白與擬南芥中的bHLH122轉錄因子并沒有被劃分在同一分支上，即它們之間的親緣關系并沒有比甘藍、白菜、蘿卜等物種近，這也暗示著它們之間的生物學功能可能在進化過程中出現了分化.

3.4 BnbHLH122蛋白的亞細胞定位

將構建好的pBI221-BnbHLH122-1-EGFP和pBI221-BnbHLH122-2-EGFP重組質粒轉入煙草原生質體進行瞬時表達，結果如圖3所示，在對照組35S-EGFP中，煙草原生質體的細胞核和細胞質內均觀察到綠色熒光信號，而在實驗組35S∶∶BnbHLH122-1-EGFP和35S∶∶BnbHLH122-2-EGFP中，只在煙草原生質體的細胞核內觀察到較強的綠色熒光信號，表明BnbHLH122-1和BnbHLH122-2蛋白定位在細胞核，這符合轉錄因子的一般特征.

3.5 BnbHLH122蛋白的轉錄激活活性驗證

轉錄激活活性驗證結果如圖4所示，在二缺(SD/-Leu-Trp)平板上無論是兩個實驗組還是對照組的酵母細胞都能正常生長，表明實驗組和對照組的質粒都成功共轉化進了酵母細胞，并且pGBKT7質粒中的TRP1基因和pGADT7質粒中的LEU2基因在酵母細胞中均正常表達.但是，在四缺平板(SD/-Leu-Trp-His-Ade)上只有兩個實驗組pGBKT7-BnbHLH122-1+pGADT7和pGBKT7-BnbHLH122-2+pGADT7的酵母細胞能夠正常生長，對照組pGBKT7+pGADT7的酵母細胞不能正常生長，由此說明BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因所編碼的兩個蛋白均具有轉錄激活活性，能夠啟動下游報告基因的表達.

圖3 甘藍型油菜BnbHLH122蛋白的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of BnbHLH122

3.6 BnbHLH122基因時空表達模式分析

利用qRT-PCR分析甘藍型油菜BnbHLH122基因的時空表達模式，結果如圖5所示，甘藍型油菜BnbHLH122基因在植株苗期、抽薹期以及花期的根、莖、葉、花中均有表達.從苗期到花期，甘藍型油菜的根和葉中的BnbHLH122-1基因的表達水平呈現出上升趨勢，而莖中BnbHLH122-1基因的表達水平相對較低且穩定，整體而言，BnbHLH122-1基因在花期的根中的表達量最高.從苗期到花期，BnbHLH122-2基因的表達水平在根、莖、葉中均呈現出先下降后上升的趨勢，在抽薹期的表達量相對較低.整體而言，相較于其他組織器官，莖中BnbHLH122-2基因的表達量相對較低，在苗期的根中和花期的花中BnbHLH122-2基因的表達量最高.

圖4 BnbHLH122蛋白轉錄活性驗證結果

3.7 逆境脅迫和激素處理下的BnbHLH122基因表達響應

在非生物脅迫條件下，甘藍型油菜BnbHLH122基因的表達情況見圖6(a)～(e).在低溫脅迫下，BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因的表達均受抑制，分別在脅迫后的第6和2 h表達量降至最小值，分別是0 h的0.5和0.2倍.在高溫脅迫下，BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因的表達水平均呈現先上升后下降的趨勢，分別在脅迫后的第8 h和4 h表達量達到最大值，分別是0 h的10倍和5.4倍.在干旱脅迫下，2個BnbHLH122基因的表達均受誘導，且均在脅迫后的第48 h表達量達到最大值，分別為0 h的3.8倍和3.9倍.此外，BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因還能響應高鹽和滲透脅迫，表達量均呈現先上升后下降的趨勢，在鹽脅迫后的第12 h表達量均達到最大值，分別約為0 h的4倍和3.5倍，在滲透脅迫后第12 h、第9 h表達量分別達到最大值，分別是0 h的6.8倍和9.2倍.

在核盤菌脅迫下，2個BnbHLH122-2基因的表達量均呈現先上升后下降的趨勢(見圖6(f))，在脅迫后的第9 h時BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因的表達量均達到最大值，分別為0 h的3.5倍和2倍，之后基因的表達量開始下調，到第72h表達量降到最低值，分別為0 h的0.2倍和0.03倍.

在外源激素ABA、SA和MeJA處理條件下，甘藍型油菜BnbHLH122基因的表達情況如圖6(g)～(i)所示，甘藍型油菜BnbHLH122-1基因的表達受ABA、SA和MeJA的誘導，分別在處理后的第6、12和6 h時表達量達到最大值，分別為0 h的3、11.4和4倍，BnbHLH122-2基因的表達受外源激素SA的誘導，在第6 h達到最大值為0 h的6.9倍，而在ABA和MeJA處理條件下，該基因的表達量下降，分別在第3 h和6 h達到最低值，均只有0 h的0.08倍.

3.8 BnbHLH122基因的啟動子序列分析

通過PlantCARE在線軟件對兩個BnbHLH122參考基因的啟動子序列進行分析，結果顯示它們的啟動子均含有參與ABA響應的元件順式作用元件ABRE以及參與MeJA響應的順式作用元件CGTCA-motif、TGACG-motif.此外，LOC106346071參考基因的啟動子區還包含參與SA響應的順式作用元件.

圖6 BnbHLH122基因在不同脅迫和激素處理下的表達分析

4 討 論

bHLH轉錄因子家族廣泛分布在真核生物體內，是植物體內不可缺少的調控因子.本實驗從甘藍型油菜中克隆到2個基因，分別命名為：BnbHLH122-1、BnbHLH122-2.經序列比對、生物信息學分析、亞細胞定位和轉錄激活活性驗證實驗結果表明克隆所得基因為甘藍型油菜bHLH122轉錄因子基因，且BnbHLH122-1、BnbHLH122-2和AtbHLH122基因的氨基酸序列、蛋白質結構均不完全相同，2個BnbHLH122基因分別與白菜、甘藍中的bHLH122轉錄因子基因的同源性較高，與AtbHLH122基因不屬于同一分支，由此推測它們發揮的生物學功能可能存在差異.

研究表明，植物bHLH轉錄因子能夠結合在下游基因啟動子區的E-box順式作用元件上，調控相關基因的表達[14]，參與植物的生長發育和抗逆反應，例如擬南芥bHLH122轉錄因子可以參與調節CO基因的表達從而影響擬南芥花周期，促使植株出現早花現象；煙草NtbHLH123轉錄因子能夠激活NtCBF基因的表達，提高植株對冷脅迫的耐受性[10].本實驗通過qRT-PCR技術分析了2個BnbHLH122基因的時空表達模式和脅迫響應，結果發現它們主要在甘藍型油菜的根和花中表達，并且響應低溫、高溫、干旱、高鹽、滲透以及核盤菌脅迫，在多種脅迫條件(如低溫、高溫、滲透等)下兩個基因的表達模式存在差異，例如表達量的極值、達到極值的時間點以及表達量上調或者下調后持續的時間等，因此推測BnbHLH122-1基因和BnbHLH122-2基因不僅能夠參與調節甘藍型油菜的花和根的生長發育過程，在甘藍型油菜抵御生物脅迫和非生物脅迫過程中發揮著重要的調節，并且它們之間可能不存在功能冗余，而是通過相互配合共同參與調控，但具體的調節機制需要進一步研究.

植物激素ABA、JA所介導的信號轉導途徑不僅能夠參與調節植物的生長發育，同時也在植物抵御外界脅迫過程中發揮重要作用[16-17].研究表明，一些bHLH轉錄因子能夠通過調節ABA和JA信號通路參與植物的抗逆過程，如bHLH轉錄因子ZmPIF3是ABA信號途徑中的正向調節因子，它通過減少氣孔開口以控制水分流失來增強植株節水和抗旱性狀[18]等.本次實驗結果表明甘藍型油菜BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因響應ABA和MeJA激素處理，但兩者的響應模式存在明顯差異，而且BnbHLH122基因的啟動子區還含有依賴于ABA信號通路的響應元件ABRE以及MeJA響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif，由此推測甘藍型油菜中的BnbHLH122-1和BnbHLH122-2基因對脅迫的響應過程可能依賴于ABA信號轉導途徑和MeJA信號轉導途徑，并且它們可能以不同的調節方式參與調控相關靶基因的表達，從而協同調節植物的抗逆反應.

此外，2個BnbHLH122基因的表達還受激素SA的誘導，BnbHLH122基因的啟動子區也找到了與SA信號轉導途徑相關的響應元件.SA信號通路是植物抗病過程中重要的調節途徑[19]，表達分析顯示甘藍型油菜BnbHLH122基因響應核盤菌脅迫，因此推測甘藍型油菜BnbHLH122基因可能參與調節植株的抗病過程，并且該過程還依賴于SA信號轉導途徑.但有趣的是，本實驗發現核盤菌和SA處理均能誘導BnbHLH122-2基因的表達，JA處理能抑制該基因的表達，研究表明，JA和SA所介導的信號通路能以相互拮抗的方式調控植株的抗病過程[20]，如擬南芥WRKY70轉錄因子[21]，這似乎暗示著BnbHLH122-2基因可能以JA和SA信號通路相互拮抗的方式調控植株的抗病過程.

綜上所述，甘藍型油菜BnbHLH122基因響應高溫、低溫、高鹽、干旱、滲透、核盤菌等多種脅迫，對該類基因的功能研究將有利于培育出具有更強抗逆性甘藍型油菜新品種，但它們的具體的抗逆機制尚不明確，還需進一步的探究.