先天性無痛無汗癥家系致病基因的研究*

劉智鴻，李勝，高德海，劉世祺

（1.山東省藥物研究院，山東 濟南 250062；2.濟寧醫學院附屬醫院 胃腸外科，山東 濟寧 272029）

遺傳性感覺和自主神經病Ⅳ型［又稱先天性無痛無汗癥（congenital insensitivity to pain with anhidrosis,CIPA）］是一種非常罕見的常染色體隱性遺傳病［1］，發病率約為1/25 億。1963 年SWANSON［2］將其正式命名為CIPA。DYCK［3］于1983 年將伴有痛覺缺乏的各種疾病命名為遺傳性感覺和自主神經病（hereditary sensory and autonomic neuropathy,HSAN），并根據遺傳方式和受累神經細胞或軸突的數目進行分型（共分為5 型），CIPA被定義為遺傳性感覺和自主神經障礙（HSAN）Ⅳ型。

CIPA 患者常見臨床表現全身無汗、對疼痛刺激無反應，出現反復發作不明原因的發熱、感染［4］，CIPA 患者還會出現不同程度的骨關節病變、關節腫脹［5］、關節囊松弛等病變、Charcot 關節病［6-7］及脊柱病等。CIPA 患者還存在一定程度的智力發展缺陷［1］。多數觀點普遍認為，CIPA 診斷需綜合多項資料進行分析：①明確無痛覺、無汗病史及癥狀；②痛覺、溫度覺試驗及碘淀粉法發汗定性試驗是該病癥的診斷依據；③皮膚活檢病理有助于確診，皮膚組織結構及汗腺形態正常或萎縮，周圍神經無髓鞘及細小有髓鞘纖維丟失等［1］；④檢測到NTRK1 基因突變則高度支持CIPA 診斷。符合以上條件，結合患者的具體表現，可以確診為CIPA。在國外，CIPA 患者中已有神經營養因子酪氨酸激酶受體1 型（NTRK1）為其主要致病基因報道［8-13］。INDO 等［14］于1996 年已將NTRK1 基因突變確定為CIPA 的致病原因。

本研究收集的一個CIPA 家系的基礎上，采集患者皮膚及皮下組織，進行HE 染色及免疫組織化學SP 法，觀察皮膚是否神經末梢缺如，檢測S-100 蛋白表達，明確該CIPA 患者診斷，進一步采集該CIPA 家系成員外周血，分離白細胞、提取DNA；通過外顯子測序方法，檢測該家系NTRK1基因和FAM134B 基因的突變情況，分析其結果與表型的對應關系，判斷其是否為該CIPA 家系的致病基因。以期發現全新的致病基因突變位點，為CIPA 的預防與診斷提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對象

患者男性，17 歲，因反復骨折3 年入院，自出生后全身皮膚無汗，經常出現持續高熱，體溫增高與外界溫度有關，應用抗菌藥物及藥物降溫治療無效，物理降溫有效。自幼感覺障礙、痛覺消失，對各種疼痛刺激均無反應、有自殘傾向，多次骨折并發骨髓炎，智力發育遲緩。

1.2 檢查方法

1.2.1 查體 體型消瘦，全身皮膚干燥，體表無汗毛，可見多發外傷瘢痕，部分口唇及舌部尖端殘缺，背部肩胛區皮膚有潮熱感，無腋毛、陰毛。雙手掌側皮膚增厚、結繭，掌指關節處可見皮膚皸裂。十指末端指節缺如、無指甲。下肢不等長，左下肢縮短約3 cm，膝關節囊松弛，右大腿外側手術切口部分未愈合，部分深筋膜及肌肉組織壞死、深達骨質，可見黃白色膿液，左足踇指末節缺如，左膝抽屜實驗：90°及45°均（+）。

1.2.2 實驗室檢查 肝功能：谷丙轉氨酶23 u/L，谷草轉氨酶15 u/L，堿性磷酸酶明顯升高：353 u/L，血鈣降低2.08 mmol/L，膽堿酯酶降低4 737 u/L，血鐵降低：4.4 mmol/L，尿常規未見異常，尿酸明顯升高990 μmol/L。

1.2.3 溫度覺實驗 觀察患者不能辨別冷熱，存在溫度覺障礙。

1.2.4 痛覺檢查 觀察患者全身絕大部分皮膚對疼痛刺激無反應，耳垂、陰囊部分區域痛覺減退。

1.2.5 X 射線檢查 右股骨中下段完全骨折移位，骨皮質變薄，骨質疏松（見圖1A、B）。切開復位內固定2 周后，骨折端尚未愈合（見圖1C）。2 月前左外上髁骨折內固定術后愈合不良（見圖1D）。

1.2.6 CIPA 患者皮膚及皮下活組織病理檢測 采集CIPA 患者皮膚及皮下組織，進行HE 染色及免疫組織化學檢測，觀察皮膚是否神經末梢缺如，檢測S-100 蛋白表達。

1.3 基因測序

NTRK1 及FAM134B 基因外顯子測序：采集患者、其父母及胞弟外周靜脈血，提取基因組DNA（使用QIAamp DNA Blood Mini 試劑盒，德國）［15］。使用Primer 3 設計引物，擴增NTRK1 的1～17 外顯子及其與內含子交界區。PCR 反應體系共30 μL：Taq mix15 μL，正反向引物各1 μL，基因組DNA 2 μL 和ddH2O 11 μL。PCR 反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s；72℃延伸20～60 s，循環35 次；總延伸72℃×10 min。PCR擴增產物純化后使用ABI3700 熒光自動測序儀（美國賽默飛世爾）進行測序［15］，測序結果與參考序列NM002529.3 比對，以確定NTRK1 突變位點及類型。并進一步與NCBI SNP、人類基因突變數據庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）和遺傳性周圍神經病變突變數據庫（http：//www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Mutations/Mutations.cfm）進行比對，排除變異位點為基因多態性位點，并確定其是否為新的突變位點。

圖1 CIPA 患者的X 線表現

2 結果

2.1 常規檢查結果

患者病史采集符合典型CIPA 臨床表現：該CIPA 患者出生后出現反復持續高熱，體溫隨外界溫度增高，全身皮膚無汗。自幼疼痛刺激感覺障礙，痛覺消失，有自殘傾向，頻繁受傷，多次骨折并發骨髓炎，恢復慢。智力發育不正常，伴有輕度的智力障礙。

CIPA 患者皮膚及皮下組織病理檢查：鏡下觀察表皮未見毛囊，可見汗腺萎縮（見圖2、3）。

2.2 基因測序結果

CIPA 家系成員（見圖4）基因測序編號父親（1 號）、母親（2 號）、患者（3 號）及患者弟弟（4 號）。

圖2 CIPA 患者皮膚的顯微鏡檢查

圖3 CIPA 患者皮膚免疫組織化學檢查

圖4 該CIPA 患者的遺傳家族圖譜

2.3 NTRK1 測序結果

首先對CITP 家系1 號、2 號和4 號個體NTRK 基因1 進行測序，然后與NTRK1 基因參考序列NM_001012331 進行比對，結果發現由于NTRK1 基因的第一個外顯子完全位于高GC 區（%GC=70%），以至于用專門擴增高GC 含量的DNA 聚合酶也不能擴增該外顯子。對NTRK1 其他外顯子的分析結果如下：NTRK1 的外顯子3-12、14 和16 均正常。其中在外顯子13 有一個常見SNP,rs6334,C/T,1 號患者為C/C 純合，2 號患者為T/T 純合，4 號患者為C/T 雜合。外顯子2 序列（見圖5）在4 個樣品中完全正常，然而在內含子2 的GT 后面堿基2 號樣品中為G，在1 號、3 號和4 號樣品中為一個Indel 突變。

外顯子15（見圖6）中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸,V）→ATG（蛋氨酸,M）。1 號樣本為G TG；2 號樣本為G/A TG；3 號樣本為G/A TG；4 號樣本為G TG。該突變為新突變，為非同義突變。

圖5 CIPA 家系成員NTRK1 基因中內含子2 的測序結果

圖6 CIPA 家系成員NTRK1 基因中外顯子15 的測序結果

其次對CITP 家系的1 號、2 號和4 號個體FAM134B 基因進行測序，然后與FAM134B 基因的參考序列NM_001034850 進行比對，結果發現由于該基因的第一個外顯子也位于高GC 含量區域，故該外顯子亦未擴增成功；同時因為在該基因內部有較多相對簡單序列的重復，故測序成功率較低，雖然進行了多次擴增和測序，目前還有一些外顯子未擴增成功或測序效果較差。可考慮進行克隆測序，但會增加實驗成本。

3 討論

CIPA 是一種罕見的常染色體隱性遺傳病［1-2］。在國外，CIPA 患者中已有NTRK1 為其主要致病基因報 道［10-13］。INDO 等［14］于1996 年已將NTRK1 基因突變確定為CIPA 的致病原因。NTRK1 蛋白胞外結構域是神經生長因子（nerve growth factor,NGF）的結合位點，可誘導神經軸突生長和促進胚胎感覺和交感神經元存活。NGF 作用通路中的缺陷會影響其他神經元存活，并導致細胞凋亡。其中NTRK1 基因的突變，可影響神經細胞外結構，進而影響細胞內信號的正常傳導。NTRKl 基因突變阻斷NGF 的作用通路，從而導致疾病的發生。CIPA 患者因為缺少對NGF 信號的轉導，造成依賴NGF 的神經元在發育中凋亡，致使背根神經節和皮膚中無細小的有髓鞘神經纖維與無髓鞘神經纖維，皮膚中的汗腺缺乏自主交感神經元的支配，最終造成淺表性痛覺的喪失和無汗現象［7］。該CIPA 患者皮膚及皮下組織病理活檢證實汗腺萎縮，皮膚周遭神經無髓鞘，同時存在小有髓鞘纖維缺失，可以解釋CIPA 患者痛覺減退和無汗癥狀。

NGF 除作用神經系統外［8］，可參與部分過敏性、免疫缺陷性和自身免疫性疾病等的發病［9］。CIPA 患者由于NTRK1 分子存在缺陷，NGF 信號無法得正常傳遞，導致中性粒細胞的趨化活性變弱［12］和B 淋巴母細胞系功能失常［13］，機體抵抗力差，容易出現感染。

隨著外顯子技術的發展，對NTRK1 基因的研究更加深入、更加系統［16］，尤其是對其基因內多態位點的研究［3］。近年來多項研究發現，CIPA 存在多種NTRK1 基因突變［3，14，17-18］。但突變方式迄今尚未完全闡明，據不完全統計，32 個CIPA 患者及家庭成員的基因分析確定了25 種突變［14］。其中6 個為移碼突變，4 個為無義突變，11 個為錯義突變，4 個為剪接突變［3］。此后其他突變也被世界各地學者陸續報道［18-22］。截至目前人類基因突變數據庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）已確定的CIPA 患者NTRK1 基因突變總數共79個，分布于NTRK1 整個區域，多數突變位于12～17 外顯子區，包括43 個錯義突變或無義突變、11個剪接異常突變、12 個微小缺失突變和10 個插入突變，以及僅有1 個大片段缺失突變，其位于gDNA 水平上的985bp,g.7335164_7336545 突變［23］表現為CIPA。其中2/3 的NTRK1 基因突變集中在日本。

該CIPA 家系成員NRK1 基因外顯子測序中，外顯子2 序列在4 個樣品中完全正常，然而在內含子2 的GT 后面堿基在2 號樣品中為G，在1號、3 號和4 號樣品中為一個Indel 突變，由于該突變在剪接位點內，其產生的后果極為嚴重，會影響內含子2 或外顯子2 的剪接。外顯子15 中，發現679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）突變為ATG（蛋氨酸，M），在1 號、4 號樣本為G TG；2 號樣本為G/A TG；3 號樣本為G/A TG。該突變為新突變，為非同義突變，分析該突變只有母親和患者存在。結合內含子2 中只有母親不存在Indel 突變，推測內含子2 中Indel 突變和外顯子15 中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）→ATG（蛋氨酸，M）共同作用下，可能會導致該疾病的發病，但因該疾病為罕見病例，樣本量有限，進一步驗證困難。

有研究發現，HSAN Ⅱ型（先天性感覺性神經病）致病原因為5 號染色體上的FAM134B 基因發生了變異［15］。FAM134B 基因常見于背根節神經元中，后者是負責將感覺信息傳遞給中樞神經系統的初級感覺神經元。FAM134B 基因變異也會導致其無法表達，使患者痛感喪失或減弱。由于CIPA致病基因迄今未完全闡明，HSAN Ⅱ型及HSAN Ⅳ型（CIPA）均為感覺障礙性疾病，均表現痛覺減退或消失，不能完全排除FAM134B 為CIPA 致病基因。相關文獻未查見CIPA 患者行FAM134B 基因檢測報道，該CIPA 家系成員FAM134B 基因外顯子測序未發現有意義突變，部分外顯子測序不成功，需進行克隆測序以進一步明確。

綜上所述，通過病史采集、體格檢查、痛溫度覺實驗及皮膚病理活檢，可以臨床確診該患者為先天性無痛無汗癥。通過外顯子測序方法，發現NTRK1 基因內含子2 中Indel 突變和外顯子15中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）→ATG（蛋氨酸，M）突變，推測此兩種突變共同作用下，可能會導致該疾病的發病，但進一步驗證困難。FAM134B 基因未發現有意義突變，不能驗證為致病基因，可能存在其他致病基因，需要進一步研究。