尿毒營養合劑質量標準研究*

楊 亮，曾 真，李正勝，樸春梅，周訓蓉

（貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003）

全球慢性腎臟病（CKD）患者數量呈增長趨勢，已成為威脅人類健康的重要疾病之一［1］。CKD 導致的高磷血癥和一些慢性磷酸鈣穩態紊亂，統稱CKD 相關礦物質及骨代謝紊亂（CKD-MBD），是CKD 的主要并發癥，嚴重影響血液透析患者的預后［2-3］。目前，西醫的診療方案不能完全改善CKD-MBD 狀態［4］。尿毒營養合劑為我院醫院制劑，根據CKD-MBD 患者脾腎虧虛、濁毒內蘊、血絡瘀阻的病機特點，以黃芪、白術、黨參、山藥益氣健脾，茯苓、薏苡仁健脾利濕，地錦草、大黃瀉火解毒，建曲消食和胃，肉蓯蓉、黃精補腎填精，縱觀全方，既補后天之脾氣，亦補先天之腎精，化瘀泄濁，補瀉兼施，使脾氣健運，胃復和降，腎精充盈，諸證自除。前期臨床研究表明，該制劑可改善維持性血液透析患者礦物質和骨代謝狀況及中醫臨床癥狀積分［5］。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別黃芪、茯苓、白術和山藥，采用高效液相色譜（HPLC）法測定君藥黃芪主要成分黃芪甲苷的含量［6］，為尿毒營養合劑質量標準的建立提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，包括蒸發光散射檢測器（ELSD），均購自美國 Agilent 公司；MS105DU 型電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；KQ-500DA 型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型恒溫水浴鍋（江蘇省常州澳華儀器有限公司）；TG-18 型高速離心機（山東博科生物有限公司）。

1.2 試藥

尿毒營養合劑（批號分別為 160501，160502，160503），缺黃芪、茯苓、白術、山藥的陰性樣品，均由醫院制劑室提供；黃芪甲苷對照品（批號為110781-201616，含量為97.4%），黃芪對照藥材（批號為 120974-201612），茯苓對照藥材（批號為121117-201502），白術對照藥材（批號為120925-201610），山藥對照藥材（批號為121137-201504），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠、浙江臺州黃巖區路橋生化塑料廠）；硅膠HSG 薄層板（煙臺江友硅膠開發有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，加水20 mL，混勻，用正己烷振搖提取2 次，每次40 mL，棄去正己烷液，合并水液；用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次40 mL，合并水飽和的正丁醇液；用氨試液洗滌2 次，每次50 mL，合并水飽和的正丁醇液；用水洗滌2 次，每次50 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液［7］。取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。取黃芪對照藥材粉末2 g，精密稱定，同法制備對照藥材溶液。取缺黃芪的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 項下方法試驗［8］，分別量取上述 4 種溶液各 10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 -甲醇 -水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）5 ～10 ℃條件下放置12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液及對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖1 A。

2.1.2 茯苓

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，加水20 mL，混勻，用正己烷振搖提取2 次，每次40 mL，合并正己烷液，揮干，殘渣加正己烷1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取茯苓對照藥材1 g，精密稱定，加水適量，煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺茯苓的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液［11］。按 2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗，分別量取上述3 種溶液各20 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60 ～ 90 ℃ ）- 乙醚（1 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖1 B。

2.1.3 白術

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取白術對照藥材1 g，精密稱定，加水適量，煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺白術的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗［7］，分別量取上述3 種溶液各10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 - 乙酸乙酯（9 ∶1，V ／ V）為展開劑［12］，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖 1 C。

2.1.4 山藥

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取山藥對照藥材1 g，精密稱定，加水適量煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺山藥的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗［7］，分別量取上述3 種溶液各10μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯（12 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰［13］。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 D。

2.2 含量測定［8］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（34 ∶66，V ／ V）；流速：1 mL ／min；檢測器：ELSD；柱溫：30 ℃ ；漂移管溫度：60 ℃［8］。

2.2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含黃芪甲苷0.8 mg 的溶液，即得對照品溶液。取2.1.1 項下供試品溶液，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液［14］。按尿毒營養合劑處方及工藝制備缺黃芪的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果理論板數按黃芪甲苷峰計應不低于3 000，分離度均大于4 000。

專屬性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果陰性對照品溶液色譜圖中，在與黃芪甲苷對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系考察：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.865 3 mg／mL 的對照品溶液，精密量取 1，2，5，10，20 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷進樣量的自然對數值（X）為橫坐標、峰面積自然對數值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y ＝1.5413X-3.7802（r ＝0.9950）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在 0.87 ～ 17.31 μg 范圍內的自然對數值與峰面積自然對數值線性關系良好。

精密度試驗：取 2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果黃芪甲苷峰面積自然對數值的 RSD 為0.23%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，1，4，8，13，20，40 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果黃芪甲苷峰面積的RSD 為 0.84% （n ＝ 7），表明供試品溶液在室溫放置40 h 內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為160501）適量，精密稱定，共 6 份，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果黃芪甲苷含量平均值為0.031 35 mg／mL，RSD為 2.90%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為160501）適量，共6 份，分別加入一定質量濃度的黃芪甲苷對照品溶液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Results of recovery tests（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測定結果（mg／mL，n ＝2）Tab.2 Results of content determination of astragaloside Ⅳ in the samples（mg ／mL，n ＝ 2）

3 討論

預試驗中比較了樣品加乙醚振搖及樣品濃縮加硅藻土，以甲醇、水飽和的正丁醇分別加熱回流提取樣品前處理方法，結果均出現斑點分離不佳、拖尾嚴重或提取過程乳化較嚴重的現象。參考文獻［15］考察展開劑，黃芪TLC 鑒別中考察了三氯甲烷 -甲醇 -水（30 ∶10 ∶1，V ／ V ／ V）和三氯甲烷 - 甲醇（10 ∶1，V ／ V），茯苓 TLC 鑒定考察了石油醚（60 ～90 ℃ ）-乙醚（3 ∶2，V ／ V）和石油醚（60 ～ 90 ℃ ）- 乙酸乙酯（1 ∶1，V ／ V），白術 TLC 鑒別中考察了石油醚（60 ～90 ℃ ）-乙酸乙酯（5 ∶1，50 ∶1，V ／ V），山藥 TLC 鑒定考察了正丁醇 -冰醋酸 -水（4 ∶1，V ／ V）和乙酸乙酯 -甲醇 -濃氨試液（9 ∶1 ∶0.5，V／ V／ V），結果均欠佳。TLC 耐用性分別考察了25 ℃下不同相對濕度（35%，59%，75%），以及相對濕度59%時不同溫度（10，25，35 ℃）對 TLC 結果的影響，結果文中所用定性鑒別方法耐用性均較好。

黃芪甲苷作為尿毒營養合劑方中君藥黃芪的有效成分［16］，因其無紫外吸收的結構特性，提取純化及檢測方法較其他成分更復雜。預試驗中，供試品溶液制備方法對比了加硅藻土、乙醚、振搖提取結果。色譜條件考察了不同廠家 C18柱，不同流動相［乙腈 - 水（32 ∶68，V ／ V）和0.1%甲酸（冰醋酸）-乙腈等］的流動性，不同柱溫（30，35，40 ℃），不同漂移管溫度（50，60，70 ℃）對含量測定結果的影響。結果黃芪甲苷分離度欠佳，陰性樣品中某些成分存在干擾，最終建立了文中所用制備方法及色譜條件。

綜上所述，該研究所建立的方法可用于尿毒營養合劑的質量控制。