circ_0003159 對胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響及機制研究

邰小華 馮聯忠 章波 張斌忠 李斌 王胤達

近年來，circRNAs 被廣泛報道其作為促癌基因或抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發生、發展進程密切相關[1]，例如circ_OSBPL10[2]、circ_006100[3]和circ_SERPINE2[4]可促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移。Tian 等[5]研究發現，circ_0003159 在胃癌組織中低表達，且低表達circ_0003159 與胃癌轉移和腫瘤大小呈正相關。此外，circRNA-miRNA-mRNA 調控網絡參與調控多種惡性腫瘤細胞的惡性生物學行為[6]。starBase 數據庫顯示，miR-32-5p 作為促癌基因以及circ_0003159 的潛在靶基因之一，在多種惡性腫瘤組織中高表達[7-8]。同時，第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）作為miR-32-5p 的潛在靶基因之一，過表達PTEN 可顯著抑制腫瘤細胞的生物學行為[9]。然而，目前circ_0003159/miR-32-5p/PTEN 分子軸調控胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用機制尚未見報道。因此，本研究擬探討circ_0003159 對胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響以及其潛在作用機制，以期為胃癌早期診斷和臨床治療提供潛在的生物分子靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2015 年6 月至2018 年12 月嘉興市第二醫院腫瘤外科經手術切除的30 例患者的胃癌組織和配對的癌旁組織（距離腫瘤≥5 cm）。納入標準：（1）經X 線鋇餐、腹部超聲、螺旋CT 與正電子發射成像、腫瘤標志物以及病理學檢查確診為胃癌；（2）術前未經放療、化療以及免疫治療；（3）患者沒有其他的重大疾病。手術前均告知患者并簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 細胞和主要試劑 人胃癌細胞系（BGC823、AGS、MKN45）以及人胃黏膜上皮細胞GES-1 均購自中國科學院上海細胞庫；細胞培養基DMEM（500 ml，批號：11965-092）、胰蛋白酶（500 ml，批號：25200072）和FBS（500 ml，批號：10100）均購自美國Gibco 公司；青霉素和鏈霉素均購自上海碧云天生物技術有限公司（100 ml，批 號：C0222）；Trizol 試 劑 購 自 美 國Invitrogen 公 司（200 ml，批號：15596018）；circ_0003159 模擬物（pcDNA3.1-circ_0003159）、空載體陰性對照物（pcDNA3.1-NC）、miR-32-5p 模擬物（miR-32-5p mimic）及空載體對照物（mimic-NC）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipofectamineTM3000 購自北京BioTeKe 公司（批號：BP2041）；逆轉錄試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司（批號：KGA1311）；CCK-8 試劑盒購自日本Dojindo公司（批號：CK04）；Transwell 小室（批號：3422）和Matrigel（批號：354234）均購自美國康寧公司；兔抗人PTEN（批號：9188）、β-actin 單克隆抗體（批號：4970）和辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗鼠IgG（批號：7077）均購自美國Cell signaling Technology 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo 公司（1 000 ml，批號：23229）；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega 公司（批號：LF103）。

1.3 細胞培養、轉染和分組 采用含有10%FBS 和雙抗（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）的DMEM 培養人胃癌細胞系和人胃黏膜上皮細胞，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。待BGC823 細胞生長密度達到80%時，采用胰酶消化細胞，并將收集到的細胞于2×105個/孔的濃度接種到6 孔板中，同時將BGC823 細胞分為以下組別：circ_0003159 超表達組（轉染pcDNA3.1-circ_0003159）、陰性對照組（轉染pcDNA3.1-NC）、過表達miR-32-5p 組（轉染miR-32-5p mimic）及對照組（轉染mimic-NC）。轉染時嚴格參照LipofectamineTM 3000試劑說明書進行操作，并將上述載體轉染于細胞中，并繼續培養6 h 后，更換正常培養基DMEM 繼續培養48 h后用于后續實驗。

1.4 circ_0003159、PTEN 和miR-32-5p 的相對表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。收集人胃癌組織、癌旁組織、生長對數期胃癌細胞BGC823、AGS、MKN45 以及正常胃黏膜上皮細胞GES-1，采用TRIzol 提取組織和細胞中總RNA，并采用NanoDrop 檢測RNA 的濃度。隨后，采用一步法逆轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，嚴格按照qPCR 試劑盒說明書檢測circ_0003159 和miR-32-5p 的mRNA 表達水平，以U6 作為miR-32-5p 的內參，以及GAPDH 作為circ_0003159 和PTEN 的內參。circ_0003159 上游引物為5'-ACTGGGAATGGAGGAAGA-3'，下游引物為5'-TGAGAAAGGATTGAGGGAAAAG - 3' ；GAPDH 上 游 引 物 為5' - AAGCCACCC－CACTTCTCTCTAA-3'，下游為5'-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT -3'；PTEN 上 游 引 物 為 5' -ACCAGTGGCACTGTTGTTTCAC-3'，下游引物為5'-TTCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3'；miR-32-5p 上 游 引 物 為5'-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3'，下游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；U6 上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8 法。將轉染后的circ_0003159 超表達組和陰性對照組中BGC823 細胞消化制成單細胞懸液，以2×104個/孔的濃度接種于96孔板中，并在沒孔中加入100 μl DMEM 培養基，每組設置6 個復孔。置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養0、24、48和72 h 后，向每孔中加入10 μl CCK-8 溶液（0.5 mg/ml）后繼續于培養箱中孵育4 h 后，采用酶標儀檢測450 nm處的每孔光密度（OD450）值，并計算平均值。

1.6 細胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell 小室試驗。將轉染后的circ_0003159 超表達組和陰性對照組中BGC823 細胞以1×105個/孔的濃度接種于Transwell 小室上室，下室加入500 μl DMEM 培養基后常規培養24 h。培養激素后采用1%結晶紫染色20 min，并于光學顯微鏡下隨機選擇5 個視野計算侵襲和遷移細胞數，并計算平均值。對于侵襲實驗，Transwell 小室上室需采用Matrigel 膠包被，其他實驗與遷移實驗步驟一致。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 收集對數期生長期的過表達miR-32-5p 組和對照組中BGC823 細胞，以1×106個/ml 的濃度接種于12 孔板中，待細胞匯合度達到70%時，采用LipofectamineTM3000 轉染試劑，將miR-32-5p mimic 轉染至過表達miR-32-5p 組，將mimic-NC轉染至對照組，另外將pGL3 空白質粒、circ_0003159 3'-UTR 突變型（MUT）質粒或PTEN 3'-UTR MUT 質粒、circ_0003159 3'-UTR 野生型（WT）質粒或PTEN 3'-UTR WT 型質粒共轉染至兩組細胞，常規培養36 h。加入細胞裂解液裂解細胞，并于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液進行熒光素酶活力值檢測。

1.8 PTEN 蛋白相對表達水平檢測 采用Western blot法。采用RAPI 裂解液提取過表達miR-32-5p 組和對照組BGC823 細胞中的總蛋白。隨后，根據BCA 試劑盒說明書檢測提取到的蛋白質濃度。然后，進行10% SDSPAGE 分離蛋白、電轉膜法將目的條帶轉移至PVDF 膜上、以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。其次，分別加入兔抗人PTEN（1∶1 000）和β-actin 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。之后，加入HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育2 h。最后，進行ECL 染色，凝膠成像儀采集圖像；通過Image J 分析灰度值。

1.9 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件，并采用GraphPad Prism 8 對實驗數據進行繪圖。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人胃癌組織及其癌旁組織中circ_0003159、PTEN和miR-32-5p 相對表達水平比較 胃癌組織中circ_0003159 和PTEN 的相對表達水平均明顯低于癌旁組織（均P＜0.05），但胃癌組織中miR-32-5p 的相對表達水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05），見表1。

表1 circ_0003159、PTEN 和miR-32-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中相對表達水平比較

2.2 4 種細胞中circ_0003159 相對表達水平比較 胃癌細胞系BGC823、AGS、MKN45 中circ_0003159 的相對表達水平均明顯低于正常胃黏膜上皮細胞GES-1（均P＜0.05），且BGC823 細胞中circ_0003159 的相對表達水平最低，見表2。

表2 4 種細胞系中circ_0003159 相對表達水平比較

2.3 兩組轉染細胞增殖能力比較 相比于陰性對照組，circ_0003159 超表達組在48、72 h 時OD450 均明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組轉染細胞增殖能力比較

2.4 兩組轉染細胞侵襲和遷移能力比較 與陰性對照組比較，circ_0003159 超表達組中細胞侵襲數和遷移數均明顯減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表4。

表4 兩組轉染細胞的侵襲和遷移能力比較（個）

2.5 circ_0003159 和miR-32-5p 靶基因預測及驗證 預測結果可知miR-32-5p 為circ_0003159 潛在的靶基因，PTEN 是miR-32-5p 潛在的靶基因，見圖1。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與對照組比較，過表達miR-32-5p 組中circ_0003159-MUT 和PTEN-MUT 相對活力值比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），而circ_0003159-WT 和PTEN-WT 相對活力值均明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表5。

圖1 靶基因預測結果（a：miR-32-5p 與circ_0003159；b：miR-32-5p 與PTEN；PTEN 為磷酸酶及張力蛋白同源基因）

2.6 兩組轉染細胞中PTEN 蛋白相對表達水平比較與對照組相比，過表達miR-32-5p 組中PTEN 蛋白相對表達水平明顯下降（P＜0.05），見表6、圖2。

3 討論

近年來，非編碼RNA（circRNA、lncRNA 和miRNA）被廣泛報道可作為包括胃癌在內的多種惡性腫瘤發生、發展的分子標志物[10]，例如circ_0000467[11]、circ_0000592[12]和circ_0000190[13]可作為胃癌早期診斷的生物標志物。同時，多種circRNAs 通過調控癌細胞增殖、侵襲和遷移，從而介導腫瘤的發展進程[14]。例如，Liu等[15]研究表明，circ_0009910 在胃癌組織中高表達，且高水平的circ_0009910 與較差的生存期呈正相關；過表達circ_101882 可顯著促進胃癌細胞侵襲、遷移和上皮間質轉化[16]；過表達circ_104916 可抑制胃癌BGC823 和MGC803 細胞增殖和轉移[17]；本研究亦發現，circ_0003159在胃癌組織和細胞系中低表達，過表達circ_0003159 可顯著抑制胃癌BGC823 細胞增殖、侵襲和遷移能力。

circRNA 通過靶向結合下游miRNA 并介導mRNA參與調控腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。Wang 等[18]研究發現，circ_EIF4G3 可通過靶向下調miR-335 促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移。Li 等[19]研究證實，circ_0056618 可通過下調miR-206 的表達，進而抑制胃癌增殖和轉移。Sun 等[20]研究表明，circ_SFMBT2 可通過靶向下調miR-182-5p 對CREB1 表達的抑制作用，進而促進胃癌細胞增殖。胃癌組織和細胞中低表達的circ_0027599 和PHDLA1 競爭性結合miR-101 促進胃癌細胞增殖和轉移[21]。本研究結果表明，circ_0003159 通過靶向下調miR-32-5p 對PTEN 表達的抑制作用，可抑制BGC823細胞增殖、侵襲和遷移能力。此外，miR-32-5p 被報道在多種惡性腫瘤中其作為促癌基因，通過敲降miR-32-5p可顯著抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和誘導細胞凋亡[9，22]。Yan 等[23]研究發現，過表達miR-32-5p 可促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究發現，miR-32-5p在胃癌組織中高表達。

表5 兩組細胞熒光素酶相對活力值比較

表6 兩組細胞PTEN 蛋白相對表達水平比較

圖2 2 組細胞PTEN 蛋白表達的電泳圖（PTEN 為磷酸酶及張力蛋白同源基因）

大量研究證實，PTEN 作為抑癌基因在多種腫瘤組織和癌細胞系中低表達[24-25]。過表達PTEN 可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移以及誘導細胞凋亡，從而介導腫瘤的發展進程[26]。此外，也有研究證實，PTEN 可通過阻斷PI3K/Akt 通路抑制惡性腫瘤細胞生物學行為[27]，例如Liu 等[28]研究表明，PTEN 通過阻斷PI3K/Akt 通路抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移能力。Gao 等[9]研究證實，miR-32-5p 通過靶向PTEN 促進胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。同時本研究亦證實PTEN 可作為miR-32-5p的靶基因。

綜上所述，本研究證實circ_0003159 在胃癌組織和細胞中低表達，過表達circ_0003159 可顯著抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。同時，circ_0003159 可通過靶向下調miR-32-5p 對PTEN 的表達。希望通過本研究可以為臨床上治療胃癌提供潛在的分子標志物及實驗依據。