分子生物學方法在腸球菌耐藥性研究中的應用

郭嬪

（山東畜牧獸醫職業學院，山東 濰坊 261061）

0 引言

腸球菌屬于一種革蘭陽性菌，其發生感染率僅次于葡萄球菌，人體感染腸球菌之后很有可能會導致傷口感染、泌尿系統感染、腹膜炎、敗血癥、心內膜炎等疾病。而且目前萬古霉素耐藥腸球菌正在逐漸增加，所以臨床上在治療以上類型疾病的過程當中也存在著較大的困難。目前，我國對腸球菌耐藥性的研究已經到達了分子水平，所以分子生物學方式是研究腸球菌耐藥性的主要方式之一，本文就針對分子生物學方法在腸球菌耐藥性研究中的應用進行了分析，以下為具體內容。

1 飛行時間質譜和聚合酶鏈反應

聚合酶鏈式反應主要是一種能夠在人體外模擬自然DNA復制的核酸擴增技術，我國實驗室在進行腸球菌屬鑒定的過程當中主要通過生化實驗鑒定表型，其中主要包括API法和VITEK革蘭陽性菌鑒定系統[1]。各種方式能夠在24小時內得到結果，但是可靠性相對不夠，主要的原因是由于非典型的種屬和目前生化試驗設計無法相一致，或者試劑盒對于新種屬并沒有建立一個新的鑒定方式，針對這個問題，分子生物學方法就能夠解決。目前通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜的方式可以有效快速的鑒定腸球菌屬，而且所耗費的成本也比較低，具有較高的應用價值。為了建立腸球菌van的基因分型和鑒定方法，gurtler等人發展了兩種可用于高分辨率融合曲線pcr（hrmpcr）技術的多重pcr反應，檢測不同種類的van基因，得到特異性的曲線。

2 Southren雜交技術

Southren雜交技術主要是在1975年被提出來的，相關的操作步驟比較復雜，但是在進行VRE研究的過程當中，可以依照《分子克隆》的相關步驟結合自身試驗的相關數據就可以進行了[2]。Southren雜交技術還可以進行vanA基因的鑒定，一般來說vanA基因存在于腸球菌的質粒上，鑒定的時候可以通過提取腸球菌質粒的DNA，通過限制性內切酶RCORI消化質粒DNA，設計出有關vanA基因的探針，隨后進行Southren雜交技術就能夠確定vanA基因的位置。Southren雜交技術還能夠構建一個腸球菌質粒的限制性內切酶圖譜，針對不同的耐藥基因可以設計出不同的特異性引物，隨后進行Southren雜交技術的探針，通過定位就可以確定耐藥基因在限制性內切酶圖譜的位置。

3 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳主要是一種應用在分離大分子量線狀DNA中的方式，一般來說腸球菌PFGE的周期在5~7天[3]，所以進行脈沖場凝膠電泳的方式主要分成了四個步驟。第一，進行細菌基因組DNA的制備，主要包括收集菌體、增菌、低熔點瓊脂糖制作細菌包埋膠塊、蛋白酶K消化、溶菌酶溶解細菌細胞壁、多次加洗液等，以上制備工作主要花費3天左右，通過包埋膠塊的方式可以將細菌在4℃下保存1個月。第二，進行限制性內切酶酶切。選擇Smai腸球菌，在25℃的水中浸泡一夜。第三，進行脈沖場凝膠電泳。選擇實驗室需要的儀器，由于不同儀器的電泳條件是不同的，所以可以進行事先預實驗。一些學者先通過伯樂公司CHEF Mapper system 的PFGE儀器，該儀器的電泳條件為1g/dl瓊脂糖，0.5%×TBE buffer，時間調整為1~23s。實驗的過程中必須要重視脈沖場凝膠電泳這一步驟，這一步驟雖然看似簡單，但是是決定整個實驗成功與否、準確與否的關鍵，主要原因是在進行電泳的時候，DNA會隨著活動的進行而出現降解的問題，從而導致條帶模糊或者不存在條帶情況的出現，針對這個問題可以在配置電泳液的時候加入100μmol/L的硫尿[4]。第四，進行溴化乙錠染色和成像。這個步驟所耗費的時間周期比較長，所以要提高重視程度。

在進行流性疾病研究的時候，為了節省時間，在短時間內判斷出是否存在VRE爆發的情況，可以通過改進的快速分型法進行VRE的PFGE工作。主要包括以下幾種步驟。第一，50mmol/L Tril HCI（PH80），50mmol/L EDTA，1250U/ml變溶菌素，25mg/ml溶菌酶，15mg/ml蛋白酶K，環境條件為37℃，時間為10分鐘。第二，0.5mol/L DTA，1g/dl十二烷基肌氨酸鈉，400μg/ml蛋白酶K，環境條件為55℃，時間為2小時，水洗，50℃水洗10分鐘，一共操作3次。TE洗，環境條件為50℃，時間為10分鐘，次數為3次。第三，Smai（30U），25℃酶切，時間為2小時。第四，電泳時間為20小時，EB染色和成像進行25分鐘，時間一共約話費28小時。相關研究人員在進行研究的時候一定要注意，快速分型法雖然比較簡便，耗費的時間也比較短，但是對于操作者的技術要求和熟練度要求都比較高，所耗費的試劑成本也比較高，所以要在開始之前考慮清楚[5]。

4 多位點基因序列分析

多位點基因序列分析法是一種具有高分辨能力的分子生物學方式，可以通過序列不同的變化來反映不同菌株之間的進化關系，在進行分子進化學研究中發揮著重要的意義。在研究腸球菌的過程中，主要研究內容包括糞腸球菌和屎腸球菌，通過多位點基因序列分析法，可以在本地的實踐結果提交數據庫以及大型數據庫的國際網站進行查詢或比較，具有一定的便捷性。糞腸球菌和屎腸球菌的主要序列組成包括7個管家基因，主要為gdh，gyd，psts,gki，aroe，xpt,yiql[6]，根據不同實驗室的數據以及腸球菌的分型來為其提供相應的方式，這樣多位點基因序列分析數據庫就能夠為全球的流行病研究提供相應的數據，對于在全世界范圍內傳播的多重耐藥的腸球菌克隆株進行識別和跟蹤。

5 焦磷酸測序法在腸球菌耐藥機制分析

在細菌耐藥機制的研究中，許多案例需要驗證已知dna片段的序列，而這種分析可以通過測量幾十個bp來滿足，雙脫氧核苷酸法和化學法可能不是最合適的方法。焦磷酸測序技術是1987年發展起來的一種新型酶連鎖串聯測序技術。焦磷酸測序法適用于已知短序列的測序。此外，它具有快速、準確、經濟、實時檢測的特點，不需要凝膠電泳，不需要對dna樣品進行任何特殊形式的標記和染色，并且具有較高的并行性和自動化程度。目前，它在細菌耐藥機制的研究中還沒有得到廣泛的應用，但有一定的發展空間。

腸球菌，尤其是屎腸球菌，通常具有多重耐藥性，由它們引起的嚴重感染的治療可能存在問題。利奈唑胺是一種新型惡唑烷酮類抗生素，能與細菌23srrnaa結合，抑制細菌蛋白質的合成，對葡萄球菌和腸球菌均有高度耐藥性。利奈唑胺很罕見，但在使用利奈唑胺治療過程中可能發生，這與影響23srna肽基轉移酶區域的染色體突變有關。利奈唑胺抗性是由多個等位基因編碼的23個srna中的g2576t單核苷酸多態性(snp)介導的。采用焦磷酸測序法快速檢測snps，檢測并評價含有t2576突變的23srns數量。

6 結語

本文所涉及到的這些分子生物學方式主要針對的是腸球菌耐藥性所提出的，但是這些方式也可以為其他細菌的耐藥性研究提供相應的借鑒和思路。主要對飛行時間質譜和聚合酶鏈反應、Southren雜交技術、脈沖場凝膠電泳、多位點基因序列分析四種方式進行了分析，四種方式都具有一定的作用和意義，在進行腸球菌耐藥性研究方面均提供了相應的借鑒。但是我們在研究的過程當中需要注意，每一種方法都有一定的局限性，也有一定的作用，所以如何發揮不同方式的優勢，取長補短，是我們研究的主要目的和意義，也值得繼續進行探索。