陽明病（陽明腑實證）欲解時TNF-α的變化及大承氣湯干預作用的實驗研究＊

石 琳，李冰鵠，張廣梅，趙協慧，王樹林，陳湘宏，劉占厚，吳 萍

（青海大學醫學院 西寧 810001）

張仲景在《傷寒雜病論》首提六經辨證論治體系，在六經病學說中，陽明病隸屬于里證、實證，主要指病邪客于胃腸或邪氣源于胃腸的里實證。《傷寒論》180條：“陽明之為病，胃家實也。”胃家，包括足陽明胃以及手陽明大腸。《靈樞·本輸》謂：“大腸、小腸皆屬于胃。”實乃邪氣實。陽明胃腑為水谷之海，多氣多血，陽明病易從燥化、熱化。陽明病主要以胃腸燥、熱、實為病變特征，當燥熱之邪與胃腸宿滯相搏，結成燥屎，以致腸道不通，而見腹滿硬痛、不大便，甚或譫語、潮熱等，形成陽明腑實證。研究表明，陽明腑實證時存在嚴重的腸道屏障功能受損[1]，出現腸源性內毒素血癥（Intestinal endotoxemia，IETM）和腸道菌群移位，兩者作為誘發因子誘使機體炎癥反應失控，進而表達、產生、釋放大量炎癥介質[2-4]。

張仲景《傷寒論》提出的“欲解時”[5]概念是中醫天人相應思想的進一步發展。傷寒論193 條：“陽明病，欲解時，從申至戌上。”認為申至戌時正是太陽西下，陽氣衰減之時，人體熱邪順應陽氣衰減而下消，若加上正確有效的治療，有利于陽明熱邪外出，使病情發展趨于向好的時刻。大承氣湯出自張仲景的《傷寒雜病論》，具有竣下熱結之功，是瀉法的代表方劑[6]，也是治療陽明腑實證的主要方劑。研究表明，大承氣湯具有降低炎性細胞因子、抑制血清內毒素、抗炎、提高機體免疫力等藥理作用，對重要組織臟器具有保護作用[7]。目前六經病“欲解時”相關研究較少，本研究以陽明腑實證模型大鼠為研究對象，觀察陽明病“欲解時”（酉時）及其對時（卯時）TNF-α 含量的變化及大承氣湯干預效果，為臨床擇時治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠290 只，體質量（178 ± 23）g，雌雄各半，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（陜）2017-003）。

1.1.2 試劑與儀器

TNF-α 酶聯免疫試劑盒（美國云克隆生物研究所提供）。常規手術器械；超純水純化儀（Milli-Q，美國默克密理博有限公司）；DCNSG 多功能提取濃縮機組（上海達程實驗設備有限公司）；TDL5M 低速冷凍離心機；RT-2100 酶標儀與洗板機（深圳雷杜公司）；PY-2型恒溫箱（上海公私合營國光醫化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分組

分籠適應性喂養1 周后，隨機分為正常組90 只、模型組100只，大承氣湯組100只。

1.2.2 藥物制備

①造模熱藥液：根據實驗大鼠體質量按每只20 g·kg-1體質量計算總藥量，附子、肉桂、干姜以1:1:1量（購于青海省新綠洲藥業有限公司，由青海大學醫學院藥學系鑒定），加水浸泡30 min，水煎2 次（40 min/次），每次煎完用雙層清潔紗布過濾藥汁，將兩次煎液合并，加熱濃縮至含生藥量2 g·mL-1，4℃冰箱保存備用。用時將藥液加熱至37℃。②糞便混懸液：收集大鼠自身糞便磨碎，置于蒸餾水中，配制成10%混懸液。③注射用LPS 制備：大腸桿菌LPS 使用前以1.6 g·L-1濃度溶于滅菌去離子水中。④大承氣湯液：芒硝、大黃、枳實、厚樸以3∶4∶5∶5 比例，枳實、厚樸加水浸泡30 min，水煎40 min 取汁，入大黃，水煎（2 - 3）min 取汁，入芒硝溶化，雙層清潔紗布過濾，加熱濃縮至2 g·mL-1，4℃保存備用。

1.2.3 模型復制及給藥方法

參照樊新榮等[8]造模方法，建立陽明腑實證動物模型。

實驗第1-12天：模型組、大承氣湯組大鼠每天按每只20 g·kg-1劑量灌熱藥液，正常組灌等量蒸餾水，每5 天稱重1 次以調整藥量，連續灌胃12 天。第13-14天：禁食不禁水12 h 后，模型組、大承氣湯組大鼠給予自身糞便混懸液灌胃，2 mL/只，正常組灌等量蒸餾水，2 次/日，連續2 天。第15 日：正常組、模型組、大承氣湯組再次隨機分為欲解時組與非欲解時組，模型組、大承氣湯組欲解時組于當日14:00、非欲解時組于次日凌晨2:00 予以5 mg·kg-1脂多糖腹腔注射，正常組欲解時組當日14:00、非欲解時組次日凌晨2:00大鼠腹腔注射生理鹽水。

模型判定：①大鼠進食量較少，行動遲慢，精神萎靡不振，體質量略有下降，掙扎無力，排便干結且次數減少，偶有成硬球；②體溫先降低后升高。同時具備2個條件提示造模成功。造模成功后，非欲解時和欲解時大承氣湯組于每日5:00、17:00 予以大承氣湯2 mL·100 g-1灌胃，正常組和模型組灌等量蒸餾水，2 次/日。觀察大承氣湯組大鼠肛周污物明顯增加，瀉下稀溏樣便后分別在陽明病欲解時中心時（酉時）17:00-19:00隨機取欲解時模型組、大承氣湯組大鼠10 只，正常組大鼠9只，陽明病欲解時中心時對時（卯時）5:00-7:00隨機取非欲解時模型組、大承氣湯組大鼠10 只，正常組大鼠9只，剪斷大鼠頸部將其斷頭處死，將老鼠規定在鼠板上，逐層分離下腹部，截取小腸中段組織，預冷的生理鹽水漂洗干凈，注射器沖洗腸管內部，稱取0.1 g 腸組織塊數段，收集于凍存管中，-80℃冰箱保存制備組織勻漿。連續取材5天。

1.2.4 效應指標及檢測方法

標準品的稀釋、加樣與測定根據試劑使用說明書的要求，配置大鼠TNF-α 標準溶液，并在板孔內稀釋為不同濃度梯度，復孔制作標準曲線。設空白和質控復孔，空白孔加100μL 標準品稀釋液，余孔加大鼠組織勻漿100μL，酶標板覆膜，37℃溫育1 h。棄去液體甩干后每孔加檢測溶液A 工作液100 μL（臨用前配制），酶標板覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，每孔用350 μL 的洗滌液洗滌，浸泡（1-2）min，重復洗板3次。每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100μL，酶標板覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內液體，甩干，洗板5 次。每孔加TMB 底物溶液90μL，酶標板覆膜，37℃避光顯色。每孔加終止溶液50μL，終止反應，確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度值。

1.2.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，檢驗水準α= 0.05，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

模型組、大承氣湯組大鼠給予12天熱藥灌胃后出現體質量降低，豎毛，活動增加，飲水量增加，尿量減少、發黃；給予自身糞便混懸液后出現排便時間延長，大便干結，呈串珠、圓珠狀；腹腔注射脂多糖后，實驗大鼠進食量減少，行動遲慢，精神不佳，體質量略有下降，排便次數減少，糞便干結，肛溫先降低后升高；大承氣湯組大鼠給予大承氣湯干預后精神狀態差，活動減少，抓取時反應較快，呼吸較為急促，飲食飲水量有所增加，大小便次數增多，且肛周污物明顯增加或大便稀溏。

2.2 實驗大鼠各組TNF-α含量變化

結果顯示，模型組、大承氣湯組陽明病非欲解時第4 天TNF-α 表達高于正常組（P＜0.01），欲解時第1-3 天TNF-α 表達均高于正常組（P＜0.01）。欲解時大承氣湯組第3、4 天TNF-α 表達與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。模型組欲解時第1、2、3 天TNFα 表達高于非欲解時（P＜0.01），大承氣湯組第1、3 天TNF-α表達高于非欲解時（P＜0.01），第4天低于非欲解時（P＜0.05）（表1、表2）。

表1 陽明病非欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

表1 陽明病非欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一時點與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

時間第1天第2天第3天第4天第5天陽明病非欲解時（5-7時）正常組（N=9）129.79±0.218129.98±0.210129.56±0.056129.59±0.067130.13±0.146模型組（N=10）129.80±0.118129.97±0.138129.56±0.033129.88±0.120**130.15±0.260大承氣湯組（N=10）129.75±0.182130.10±0.082129.57±0.029129.94±0.254**130.07±0.301

表2 陽明病欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

表2 陽明病欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一時點與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；同一天同一時點與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；模型組同一天不同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；大承氣湯組同一天不同時點比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

時間第1天第2天第3天第4天第5天陽明病欲解時（17-19時）正常組（N=9）129.94±0.278129.98±0.232129.61±0.084129.89±0.243130.07±0.178模型組（N=10）130.23±0.292**△△130.32±0.115**△△129.87±0.158**△△130.00±0.192130.09±0.209大承氣湯組（N=10）130.42±0.172**▲▲130.24±0.221**130.24±0.232**＃＃▲▲129.71±0.078＃＃▲130.05±0.116

2.3 實驗大鼠各組TNF-α時間節律性變化

正常組TNF-α 表達與模型組、大承氣湯組相比呈低趨勢（P＜0.01）。模型組TNF-α 表達第2 天達到高峰，第3 天降至最低，之后趨于平穩；欲解時TNF-α 表達高于非欲解時。大承氣湯組TNF-α 表達第1-3 天與模型組節律存在一致性，但其表達量高于模型組，第4 天明顯降低（P＜0.05），第5 天各組間趨于一致（圖1）。

圖1 實驗大鼠各組第1-5天TNF-a節律變化

3 討論

《素問·生氣通天論》曰：“故陽氣者，一日而主外。平旦人氣生，日中而陽氣隆，日西而陽氣已虛，氣門乃閉。”人與自然、天地相參，人體陽氣的盛衰變化、運行規律與一天內陽氣變化大體一致。陽明之氣旺于申酉戌時（15:00-21:00），這段時間是太陽落山前后的6個小時，此時自然界中的陽氣逐漸衰退，借助逐漸衰退的陽氣，可使體內之熱隨自然界陽衰而逐漸減退，故言陽明病于此時欲解。

陽明腑實證是多種急性腹部疾病中出現的一種證候，如急性闌尾炎、急性膽道感染、腸梗阻等，陽明腑實證能使腸道病變加重，嚴重時引起多器官功能衰竭等并發癥。現代研究表明陽明腑實證的發生和內毒素血癥密切相關。陽明腑實證由于宿食積滯、燥屎內結，腸道內大量積氣，腸道壓力明顯升高[9]，同時腸道菌群失調，腸道黏膜屏障受損，腸道通透性明顯升高，腸道內革蘭陰性菌死亡后細胞壁崩解或活菌釋出內毒素，釋放入血形成腸源性內毒素血癥[10]。大量內毒素（Endotoxin，ET）與細胞上的CD14 相結合，構成LPS-CD14 受體，此受體作用于TLR4，進而激活LPSTLR4/NF-κB 信號通路，通過MyD88 蛋白轉導，激活NF-κB，NF-κB 進入細胞核，調控眾多炎性遞質的基因表達，促進TNF-α、IL-1β等細胞因子的表達[11]。該病乃危重急癥，如不及時干預，釋放入血的諸多炎癥介質進一步激活炎癥細胞通路，導致嚴重的組織損傷、功能破壞[12,13]，最終導致多器官功能障礙（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至死亡。

TNF-α 是一類具有多種生物效應的細胞因子，在信號傳導和介導T淋巴細胞增殖上發揮重要作用。研究表明，內毒素與內皮細胞、單核細胞等細胞膜上的受體相結合，激活核因子κB（NF-κB）信號通路，促進一氧化氮（Nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-a（Tumor necrosis factor，TNF-α）及白介素-1（Interleukin-1，IL-1）等大量炎性因子的分泌與釋放，誘發炎性級聯瀑布反應，從而造成組織器官受損[14]。本實驗中，總體來看，模型組大鼠TNF-α 表達較空白組高（P＜0.01），因為大鼠機體免疫調節是動態過程，非欲解時模型組大鼠TNF-α 表達較低，隨后TNF-α 表達逐漸升高，至同一天欲解時模型組大鼠TNF-α 表達高于空白組（P＜0.01），說明體內處于炎癥反應狀態。研究表明：TNFα 等細胞因子在受到LPS 或PHA 刺激后顯示晝夜波動，與刺激后的增殖反應與淋巴細胞數相對應，淋巴細胞DNA 合成的晝夜節律亦呈雙峰型，第1 個峰值出現在8:00-10:00 時，第2 個在20:00-24:00 時，谷值位于4:00 時[15]。這和本實驗TNF-α 表達的峰值、谷值相近。《傷寒論》中的六經病“欲解時”簡單來說，就是在某個時刻，該經正氣旺盛，抗邪更加有力。從中醫角度來看，TNF-α 作為炎性因子，是邪氣的一種表現，TNF-α 高表達可從側面說明機體正邪交爭之激烈，疾病可能相愈。本實驗TNF-α 陽明病欲解時與非欲解時的表達顯示出晝夜節律。尤在涇在《傷寒貫珠集》指出：“申酉戌時，日晡時也。陽明潮熱，發于日晡，陽明病解，亦于日晡。則申酉戌為陽明之時。其病者，邪氣于是發。其解者，正氣于是復也。”[16]說明在陽明欲解時TNF-α 的高表達，既是由于細胞因子大量釋放，炎癥風暴的發生，造成機體損傷，使疾病迅速惡化的時期；但也是通過免疫功能的調動，有利于疾病康復的時間。同時在陽明腑實證5 天的觀察中發現，模型組TNF-α 表達在陽明病第1 天上升，第2 天達到峰值，72 h 達到最低值，之后趨于平穩，這與許翠萍[17]等人研究相似，在疾病急性期時TNF-α釋放增加。

大承氣湯是《傷寒論》中治療陽明腑實證的代表方，由大黃、厚樸、枳實、芒硝四味藥組成，具有瀉下通里、竣下熱結的功效，主治大便不通、腹中轉矢氣、腹滿疼痛、拒按、潮熱、手足截然汗出、脈遲有力。此時痞、滿、燥、實諸證具備，故以大承氣湯攻下。原文指出：“傷寒若吐若下后不解，不大便五六日，上至十余日，日晡所發潮熱，不惡寒，獨語如見鬼狀。若劇者，發則不識人，循衣摸床，惕而不安。微喘直視，脈弦者生，澀者死。微者，但發熱譫語者，大承氣湯主之。”研究表明，具有下法的中藥能降低腸腔壓力，具有抗過氧化物損傷的作用，降低腸道內壓力，改善腸壁循環，減輕過氧化物損傷，并對腸道屏障功能具有保護作用，有利于維持水、電解質平衡[18]。君藥大黃可通過維持腸粘膜細胞的正常結構、防止或修復腸粘膜萎縮及損傷、保護腸粘膜完整性[19-20]。大黃的瀉下作用和總蒽醌的成分有關，大黃蒽醌類成分是瀉下的有效成分[21]。芒硝、厚樸、枳實和大黃配伍，能顯著增加大黃中蒽醌類成分的溶出率[22]。芒硝的瀉下作用的主要物質基礎和與硫酸鈉密切相關[23]。芒硝所含的Na2SO 可使腸內滲透壓升高，大量水分保留到腸腔，引起機械性刺激，導致排便。厚樸能緩解實驗大鼠胃腸動力障礙，促進小腸推進率[24]。厚樸的功效成分厚樸酚通過抑制氧化應激減輕細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷（Acute lung injury，ALI），下調大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量[25]。下調絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 的磷酸化水平，下調NF-κB 信號通路中核因子κB 抑制因子α（IkBa）、p65 的磷酸化水平而有明顯的抗炎活性[26]。厚樸酚還有廣譜抗菌活性，對白色念珠菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抑制作用[27]。枳實苦降，善，破氣除痞，消導積滯。四藥合用，具有強大的蕩滌腸道、峻下熱結的功效。

研究表明，大承氣湯具有減輕機體炎癥反應的作用[28-30]。季永欣[31]等研究大承氣湯能有效防治急危重癥患者腸功能障礙并改善臨床預后，其機制可能與調節TLR/MyD88/NF-κB-p65 信號通路過度激活及其下游炎癥因子（IL-1β/IL-6/IL-8/TNF-α）有關。本實驗給予大承氣湯干預后，非欲解時組間差異不明顯（P＞0.05），第4 天藥物組TNF-α 仍高表達，猜測可能此時藥物瀉下作用發揮不充分或和動物免疫晝夜節律表達相關。整體上在非欲解時點，TNF-α 沒有較明顯下降趨勢（P＞0.05），第4 天仍是一個高表達狀態；欲解時藥物組前3 天TNF-α 升高，第3 天明顯高于模型組（P＜0.01），至第4 天明顯低于模型組（P＜0.01），第5天組間無差異。且藥物組1、3 天欲解時TNF-α 表達高于非欲解時（P＜0.01），第4 天低于非欲解時（P＜0.05），說明1-3 天處于疾病急性期，機體受LPS 刺激后增殖反應加劇，盡管給予藥物干預，但此時邪氣較為旺盛，正邪交爭劇烈，故欲解時TNF-α 高表達且高于模型組，第4 天機體正氣勝邪，故TNF-α 表達下降，尤以欲解時明顯（P＜0.05），此時機體借助藥物及自然界陽氣變化而驅邪外出。本實驗給予大承氣湯干預后，欲解時組TNF-α表達總體上有下降趨勢。

綜上所述，大承氣湯可抑制下游炎性因子TNF-α表達，且在欲解時給藥效果顯著。陽明腑實證是一個臨床急性病，需要盡早干預。本實驗初探了對于陽明病（陽明腑實證）的欲解時的時間治療學意義，利用陽明病欲解時的有效時機，給予合理藥物干預，能促使疾病向好的方向變化。本實驗選取了陽明病欲解時中心時酉時（17:00-19:00）及其對時卯時（5:00-7:00）兩時點進行研究，但陽明病（陽明腑實證）欲解時本身是一個時間段，其他時點的探究需進一步挖掘。