CaM/CaMKⅡ在腸易激綜合征大鼠腦腸互動中的表達及大建中湯干預效應研究＊

武 靜，鄭清海，王 慧，楊 毅，李堯鋒，王俊霞，楊莎莎

（1. 貴州中醫藥大學基礎醫學院 貴陽 550025；2. 貴州中醫藥大學第一附屬醫院 貴陽 550002）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是常見的消化系統疾病，臨床上患者多以腹痛就診，其病理基礎為胃腸動力和內臟高敏性異常[1]。近年來研究證實CaMKⅡ在功能性胃腸病的發病中發揮重要作用，且參與痛覺過敏的形成，但作用機制不明。在此前提下本研究根據腦腸互動學說，將靶標定位到腦、腸，分別檢測大鼠下丘腦和結腸CaM 信號通路關鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白的表達，從而探討腸易激綜合征內臟痛的形成機制，并在此基礎上探討大建中湯對腸易激綜合征的治療機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 大 鼠，雌 鼠16 只，雄 性8 只，體 質 量（150-170）g，由達碩生物科技有限公司提供，實驗動物合格證號SCXK2019-15。自由飲食1 周后，為使雌鼠有效懷孕，分別將2 只雌鼠和1 只雄鼠放在一籠，雌鼠懷孕后再分開喂養。選擇48 只雄性乳大鼠作為實驗對象。

1.2 藥物及試劑

大建中湯（貴州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供）按比例（蜀椒∶干姜∶人參∶飴糖=1∶2∶1∶5）分別制成含生藥1.5 g·mL-1劑量濃度的水浸液；匹維溴銨片（MYLAN LABORATORIES SAS 公司，批準文 號H20160396）；佐劑液態鋁（Pierce 公司，批號QD218415 A）；卵清白蛋白（Sigma 公司，批號052K1275）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中山金橋生物技術有限公司，批號ZB-2301）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號PC0020）；蛋白質定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號P1511）；實時熒光定量PCR試劑盒（美國Promega公司，批號0000042197）；Cam/CaMKⅡ引物（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.3 儀器

石蠟包埋機（湖北歐美萊醫療科技有限責任公司，型號：YB-6D），石蠟切片機（德國萊卡公司，型號：RM2135），電子恒溫水浴鍋（上海勝衛電子科技有限公司，型號：J-HH-4A），光學顯微鏡（日本Nikon公司，型號：80i），多功能酶標儀（美國Perkin Elmer 公司，型號：EnSpire），Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統（美國Media Cybernetics 公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號：GelDoc2000）。

2 方法

2.1 模型制備

根據相關文獻[2]改良制備IBS 內臟痛大鼠模型。從出生第2 天起母嬰分離每天3 h（8:00-11:00），不予哺乳，正常組母子同籠；第8-21 天增加0.5%乙酸直腸內刺激，每天1 次，每隔2 天增加0.1 mL，直至0.5 mL為止，正常組等量生理鹽水灌腸。至第22 天起，正常飼養至第41 天；第42、46 天分別予腹腔注射30 g·L-1OVA 1 mL，正常組注射等量PBS；第47-57 天正常飼養。第58 天進行腹壁撤退反射（Abdominal withdrawal reaction，AWR）檢測，評價內臟敏感性。

2.2 AWR檢測

分別給予80、60、40、20 mmHg 壓力，觀察結直腸擴張（Colorectal distension，CRD）所產生的反應。每次擴張時間為20 s，重復6 次，每次間隔4 min，取6 次平均值。給與不同刺激時評分標準參照Al-chaer[3]，0分，大鼠情緒穩定；1分，偶有扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮；3分，腹背肌肉收縮的基礎上出現腹部抬離地面；4分，腹部高離地面致使腹部呈弓狀。

2.3 分組及給藥

將造模成功的大鼠分為模型組，匹維溴銨對照組，大建中湯高、中、低劑量治療組，每組8只。大建中湯組、匹維溴銨予相應藥物混懸液灌胃，正常組和模型組分別給予等量0.9%生理鹽水灌胃，給藥2 周，并再次AWR檢測。

2.4 取材

禁食12 h 后采用腹腔注射戊巴比妥鈉（0.4%，10 mL·kg-1）麻醉，冰臺上迅速取腦，分離下丘腦組織；同時切開腹腔在距離肛門7 cm 處取結腸3 cm，分3 段保存備用。

2.5 RT-PCR 檢測各組大鼠結腸、下丘腦組織CaM/CaMKⅡ基因表達

按照反轉錄試劑盒要求操作，提取總RNA 及反轉錄合成模板cDNA，放置于-20℃保存備用。目標基因引物：CaMKⅡ引物序列，上游：5'-GATGTGCGACCCT GGAATGA-3'，下 游：5'-ATGTAGGCGATGCAGGCT GAC-3'，擴增長度：183 bp；CaM 引物序列，上游：5'-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3'，下游：5'-GTCA AAGACTCGGAATGCCTCAC-3'，擴增長度：160 bp；βactin 引物序列，上游：5'-GGAGATTACTGCCCTGGC TCCTA-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3'，擴增長度：150 bp。以β-Actin 作為內參基因，得到各擴增反應的Ct值后，用比較Ct值法計算相對表達量。

2.6 Western blot 檢測各組大鼠結腸、下丘腦組織CaM/CaMKⅡ蛋白表達

分別將結腸、下丘腦組織裂解剪成碎片勻漿，離心后提取組織蛋白；采用BCA 方法在標準曲線上定量檢測目的蛋白；制膠、電泳、轉膜后免疫檢測：將PVDF膜加入適量封閉液，放入相應的一抗溶液，37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，搖床上洗膜3次，將洗好的PVDF膜放于配制好的二抗溶液，搖床上孵育2 h 再洗膜；采ECL 法顯色，并根據不同顯影光強度調整曝光條件用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行掃描分析，以βactin 與目的蛋白密度比值作為待測目的蛋白相對表達量。

2.7 統計學方法

應用SPSS19.0 統計分析軟件對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。多個樣本均數間兩兩比較，采用最小顯著差法（Least-Significant Difference，LSD）法。如樣本資料不符合方差分析的條件，則采用完全隨機設計的秩和檢驗（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠進食正常，毛發光澤，行動靈活；造模大鼠失去光澤，行動遲緩，喜好扎堆，收腹、舔舐腹部等現象；灌服大建中湯和匹維溴銨后，大鼠進食和毛發恢復正常，舔舐腹部現象消失。

3.2 對IBS內臟痛大鼠模型腹痛的影響

與正常組比較，模型組AWR 評分在60、40、20 mmHg 壓力下增加，腸道痛覺明顯上升（P＜0.05、P＜0.01），證明成功造模。與模型組相比，AWR 評分在40、20 mmHg 壓力下，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），模型大鼠腸道痛覺減輕。與匹維溴銨組相比，在40 mmHg 壓力下的AWR評分，大建中湯高劑量組治療效果要優于匹維溴銨組（P＜0.05）（表1）。

表1 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠AWR評分的影響（xˉ± S，n = 8）

3.3 對IBS內臟痛模型大鼠結腸HE染色的影響

正常組的結腸上皮組織完整，黏膜連續，淋巴細胞散在，未見水腫和潰瘍，未見明顯病理改變。模型組結腸組織黏膜層不連續，腺體輕度水腫，固有層內散在分布少量淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等。匹維溴銨組和大建中湯組大鼠結腸黏膜上皮結構較完整，腺體排列規則，固有層及黏膜肌層結構清晰，固有層內有大量大腸腺分布，杯狀細胞數量正常，肌層和漿膜層未見明顯變性壞死和炎細胞浸潤。提示大建中湯能夠顯著減輕模型大鼠腸道炎癥、改善損傷（圖1）。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學形態（HE×100）

3.4 對IBS 內臟痛模型大鼠結腸、下丘腦CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的影響

通過實時熒光定量RT-PCR 和Western Blot 技術檢測顯示，與正常組相比，模型組結腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組結腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01）（表2、表3）。

4 討論

雖然腸易激綜合征的病因和發病機制目前尚不明確，但大多數學者認為心理因素通過影響胃腸道黏膜屏障、感覺等生理功能，從而改變IBS患者的疾病體驗和行為，因此提出“腦腸互動”假說，其互動調節失常與IBS 發生關系密切[4,5]。腦腸互動是胃腸道將各種刺激信號通過脊髓背根神經節及脊髓背角神經元突觸，將內臟信息投射到感覺信息處理中樞下丘腦。下丘腦整合內臟信息后，由自主神經系統借傳出神經元將調控信息傳送到腸神經或直接作用于腸效應細胞，故本實驗將靶標定位在下丘腦和結腸，探討腦腸之間的互動機制。

表2 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠結腸、下丘腦CaM/CaMKⅡmRNA的影響（xˉ± S，n = 8）

表3 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠結腸、下丘腦CaM/CaMKⅡ蛋白的影響（xˉ± S，n = 8）

中醫學認為IBS 病位在脾胃，病因有氣滯、感寒、血凝、蟲積等，病機為脾胃虛寒，運化乏力，氣血不足“不榮則痛”及氣機阻滯，氣血經脈運行不暢“不通則痛”。《金匾要略》記載的大建中湯是治療腹痛的經典方劑，其由干姜、人參、蜀椒、飴糖組成，針對腹痛病位在脾胃，脾胃虛寒之證，具有健脾止痛、溫中散寒之功。臨床研究也表明大建中湯能夠治療多種急慢性內臟痛，療效確切[6]。

內臟高敏被認為是IBS 的最重要的病理基礎，本研究結果表明，造模大鼠出現行動遲緩、收腹、舔舐腹部、肛周污濁等現象，符合IBS 內臟痛癥狀。IBS 內臟痛大鼠AWR 評分中4個擴張壓力均有明顯升高，表明模大鼠腸道在長期的傷害性刺激下形成IBS慢性內臟痛，由于中樞以及外周的雙重疼痛敏化，大鼠痛閾降低，痛行為表現明顯。與模型組比較，經大建中湯治療后，大鼠在4 個擴張壓力下均明顯降低，趨于正常。表明大建中湯治療能夠使IBS 內臟痛大鼠痛閾升高，痛行為改善，提示大建中湯對內臟痛大鼠有明顯的鎮痛作用。

CaM 是重要的細胞信號傳遞物質，其與Ca2+形成Ca2+-CaM 復合物實現細胞內信號轉導[7]。現已證明Ca2+-CaM 信號通路廣泛存在于多種真核細胞內，Ca2+通過與CaM 結合，激活Ca 激酶Ⅱ（Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶Ⅱ）發揮作用。研究[8]表明Ca2+/CaMKⅡ是一種多功能CaM 激酶，可在細胞內被激活，在全身各組織內廣泛分布。CaMKⅡ特有的身磷酸化機制可形成突觸后膜長時程增強效應（Long-term potentiation,LTP），在中樞神經系統突觸可塑性變化中發揮重要作用。近年研究發現CaMKⅡ尚參與痛覺過敏的形成，且在功能性胃腸病的發病中亦發揮重要作用[9]。本實驗中，課題組采用母子分離、乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射等復合造模方法，成功復制IBS 內臟痛大鼠模型。與正常組相比，模型組結腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組結腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01），實驗結果呈現出了CaM/CaMKⅡ在下丘腦和結腸中含量變化的同步性，不僅進一步表明CaM/CaMKⅡ與腸易激綜合征的發病密切相關，同時也證實了“腦腸互動”學說。大建中湯能夠通過抑制CaM/CaMKⅡ含量水平，降低IBS內臟痛覺高敏狀態。實驗中我們發現，在40 mmHg 壓力下AWR 評分下大建中湯組優于匹維溴銨組，這可能與大建中湯的多靶點鎮痛作用有關。我們前期研究發現[10]，大建中湯可通過抑制神經遞質5-HT 產生和釋放，下調神經遞質5-HTP、5-HIAA 含量，從而達到鎮痛作用，而匹維溴銨針對上述疼痛靶點的作用尚未相關報道。

本課題組從CAMKⅡ信號途徑關鍵分子角度揭示腸易激綜合征的發病機制以及大建中湯作用機制和科學內涵，基于“腦腸互動”及細胞信號轉導理論探索腸易激綜合征內臟痛的發生機制，有助于尋找到中醫藥治療IBS 內臟痛的作用藥靶部位，將為加快研發治療IBS內臟痛的有效中醫復方制劑提供科學依據。