多維生物網絡探討鴉膽子治療潰瘍性結腸炎的潛在藥效成分和分子機制＊

陳文璐，王樂琪，萬力生，張怡萍，李莎莎，4＊＊，肖 雪

（1. 廣州中醫藥大學深圳市兒童醫院 深圳 518038；2. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院 廣州 510006；3. 廣東藥科大學中醫藥研究院 廣州 510006；4. 廣東省中醫藥防治難治性慢病重點實驗室 廣州 510006）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是由環境、遺傳、感染、免疫等多因素相互作用引起的結腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）[1]。臨床上以反復發作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便、里急后重為主要表現，可伴有便秘、腹脹、食欲不振、惡心等消化系統癥狀以及發熱、營養不良等全身反應，部分UC 患者可出現中毒性巨結腸、直腸結腸癌變等并發癥[2]。西醫治療上主要以5-氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物控制炎癥反應以及對癥治療為主，但長期療效欠佳，大部分患者存在復發情況。與之對應，傳統醫學在緩解UC 癥狀、預防UC 復發方面具有一定的優勢[3]。在我國，UC 近年患病率明顯增加，因此開展中醫藥治療UC的臨床應用和作用機制研究，具有較好的前景。

從中醫藥角度出發，篩選對UC 具有潛在治療作用的中藥及復方，探討其治療UC 的潛在藥效成分和作用機制，可以為UC 的治療提供更多的途徑，同時能為中藥及其復方治療UC 提供良好的示范研究。根據臨床報道和文獻研究，選擇傳統中藥鴉膽子作為研究對象。鴉膽子為苦木科植物鴉膽子Brucea javanica(L.)Merr.的干燥成熟果實，其味苦、性寒、有小毒，歸大腸、肝經，具有清熱解毒、止痢截瘧之功效[4]。《醫學衷中參西錄》中記載鴉膽子“善治熱痢赤痢，二便因熱下血，最能清血中之熱及腸中之熱”[5]。現代藥理研究表明鴉膽子具有抗瘧[6]、抗癌[7]、抗炎[8]、抗阿米巴原蟲[9]、抗胃潰瘍[10]以及調控免疫系統[11]的作用，臨床多用于治療癌癥、瘧疾、阿米巴痢疾等[12]。動物實驗表明鴉膽子藥渣可以降低腸炎小鼠的疾病活動指數和組織損傷評分，結腸組織中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ等促炎因子的水平下降，小鼠體重下降有所改善[13]，提示鴉膽子可用于治療部分腸道疾病。

網絡藥理學是生物信息學、系統生物學、多向藥理學等多學科交叉的理論，是促進中醫藥現代化的重要手段，在中醫藥研究中已經得到廣泛應用[14-15]。它的多維性與中醫藥的整體觀念類似，利用網絡藥理學方法構建“中藥-成分-靶點-疾病-通路”相關網絡，并對該生物網絡進行分析，篩選出其中可能發揮主要作用的藥效成分、關鍵靶點、通路，闡明中藥及復方在治療疾病中的具體作用機制，同時也能節約藥物研發成本，提高研發效率。基于此，本文擬采用網絡藥理學技術研究鴉膽子治療UC 的作用機制，為其臨床應用提供理論參考和支持。

1 材料與方法

1.1 鴉膽子化學成分庫構建及靶點預測

將“鴉膽子”輸入TCMGeneDIT 數據庫（http://tcm.lifescience.ntu.edu.tw/index.html）進行查詢；同時在中國知網（http://www.cnki.net/）中以“（篇名=鴉膽子）AND（篇名=成分）”為檢索條件、以“資源范圍：總庫；中英文擴展；更新時間：不限”為檢索范圍，開展文獻檢索。將二者結果相結合，整理出鴉膽子的化學成分。

通 過 ChemicaBook 數 據 庫（https://www.chemicalbook. com/）和 PubChem 數 據 庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢化學成分的CAS 號和SMILES 字符串（Simplified molecular input line entry specification，SMILES）。將得到的SMILES字符串輸入SwissTargetPrediction（http://www. swisstargetprediction.ch/，http://old.swisstargetprediction.ch/）進行化合物的靶點預測，得到鴉膽子化學成分的作用靶點。

1.2 疾病靶點預測

以“ulcerative colitis”為關鍵詞在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）進行搜索，收集與UC 相關的靶點，即疾病靶點。

將得到的疾病靶點輸入String11.0（https://stringdb.org/）中，分組選中“Multiple Proteins”，設定物種為“Homo sapiens”，其余保持默認值，得到疾病靶點互相作用關系。

1.3 “成分-疾病-潛在靶點”網絡構建

將整理好的鴉膽子“成分-靶點”信息導入Cytoscape3.7.2軟件，構建鴉膽子的“成分-靶點”圖，同時利用該軟件構建“（疾病）靶點-靶點”圖，使用軟件的Merge 功能找到以上2 個網絡中的共同靶點，即為鴉膽子治療UC 的潛在靶點。將潛在靶點輸入String11.0 中，分組選中“Multiple Proteins”，設定物種為“Homo sapiens”，其余保持默認值，得到潛在靶點互相作用網絡圖。同時利用Cytoscape3.7.2軟件構建“成分-疾病-潛在靶點”圖。

1.4 潛在靶點富集分析及網絡構建

利用Cytoscape3.7.2 軟件的ClueGo 插件對潛在靶點進行富集分析，設定P＜0.01，其余參數默認，開展GO 功能分析中的生物過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）分析；同樣條件下對潛在靶點進行KEGG通路分析，確定潛在靶點的通路。

使用Cytoscape3.7.2 軟件構建“通路-靶點”網絡，利用Merge 功能將其與“成分-疾病-潛在靶點網絡互作圖”合并，構建“成分-疾病-潛在靶點-通路網絡”網絡圖。

2 結果

2.1 鴉膽子化學成分庫構建及靶點預測

通過文獻檢索得到相關文章72篇，將其整理后與TCMGeneDIT 數據庫結果匯總并去重，共得出鴉膽子的74 個化學成分，其中能夠查詢到SMILES 字符串的成分有47個（表1）。

在SwissTargetPrediction 網站預測得到3932 個成分靶點，刪除Probability為0值（假陽性）的靶點及其對應的化學成分（Bruceine C，Bruceine E）并將靶點去重后，剩余503 個成分靶點，與45 個有效成分相對應。將“成分-靶點”信息導入Cytoscape3.7.2 軟件構建“成分-靶點”網絡圖。

2.2 疾病靶點預測及網絡構建

通過Genecards 數據庫查詢，共得到與UC 相關的靶點3870 個，說明UC 是一種由多基因調控的疾病。以“relevance score ≥10”為篩選條件，篩選出疾病靶點234個。

表1 鴉膽子化學成分表

2.3 “成分-疾病-潛在靶點”網絡圖構建

將2.2 中的234 個疾病靶點導入String11.0 數據庫，得到疾病的靶點互相作用關系圖，下載tsv 格式文本并導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建“（疾病）靶點-靶點”互作網絡圖。使用軟件的Merge功能，將“成分-靶點”網絡與“（疾病）靶點-靶點”取交集，得到疾病與成分的重合靶點41 個，即為潛在靶點，說明鴉膽子可能通過作用于這41 個靶點而對UC 產生影響。將41 個潛在靶點導入Cytoscape3.7.2軟件，構建潛在靶點互作網絡圖（圖1）。

使用Cytoscape3.7.2 軟件的Merge 功能，將“成分-靶點”網絡圖與“潛在靶點”互作圖取并集，剔除其中無潛在靶點的8個成分節點，得到“成分-疾病-潛在靶點”互作網絡圖（圖2）。鴉膽子通過多成分-多靶點作用于UC，該網絡共有邊467 條，節點78 個，其中成分節點37 個，潛在靶點節點41 個，平均鄰居節點數為11.974。計算得到該網絡中成分的平均節點度為4.027，潛在靶點的平均節點度為19.146。節點度大于4.027的成分如木犀草素、亞油酸、棕櫚酸、鴉膽亭等可能為鴉膽子發揮藥效的主要成分，節點度大于19.146的 潛 在 靶 點 如PTGS2、IL6、AKT1、EGFR、STAT3、HIF1A等可能為鴉膽子治療UC的關鍵靶點。

2.4 潛在靶點的富集分析及成分-疾病-潛在靶點-通路網絡構建

2.4.1 富集分析

使用Cytoscape3.7.2 軟件中的GlueGo 插件，對篩選出的41個潛在靶點進行GO 功能分析以及KEGG 通路分析。

圖1 潛在靶點互作圖

圖2 成分-疾病-潛在靶點網絡互作圖

輸入41 個潛在靶點，設置P＜0.01，選擇GO 功能分析中的生物過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）分析（圖3）。潛在靶點主要富集在骨骼肌衛星細胞增值的正調控（Positive regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation）、白三烯參與的炎癥反應（Leukotriene production involved in inflammatory response）、氰鈷胺素反應（Response to cobalamin）、多巴胺能的負性調節突觸傳遞（Negative regulation of synaptic transmission, dopaminergic）、缺氧時RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter in response to hypoxia）、細胞對肽聚糖的反應（Cellular response to peptidoglycan）、過氧化氫代謝過程的負調控（Negative regulation of hydrogen peroxide metabolic process）等生物過程及分子功能上。

圖3 GO功能分析結果圖

輸入41 個潛在靶點，設置P＜0.01 進行KEGG 通路分析，選取前10 條通路進行展示（圖4、表2）。由圖4 可知，鴉膽子治療UC 可能是通過癌癥相關通路（Pathway in cancer）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、AGE-RAGE 信 號 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway）、病毒感染及疾病通路等多條通路發揮作用。表2展示了富集在各條通路上的具體靶點，表明鴉膽子可能是通過調控通路上的多個靶點而影響整條通路。

圖4 KEGG通路富集分析圖

2.4.2 成分-疾病-潛在靶點-通路網絡構建

為了驗證通路與靶點之間的互作關系，選取部分通路導入Cytoscape3.7.2軟件，構建“通路-靶點”網絡，使用Merge 功能將其與“成分-疾病-潛在靶點網絡互作圖”合并，構建“成分-疾病-潛在靶點-通路”網絡圖（圖5）。該圖中邊526 條，節點106 個，其中10 個內圈節點代表通路，37 個中圈節點代表成分，59 個外圈節點代表合并后的靶點。表示鴉膽子可能是通過這37個關鍵成分，調節41 個潛在靶點的表達，并由此影響關鍵通路，從而發揮治療UC的作用。

3 討論

3.1 鴉膽子“清熱利濕”適用于UC主要證型

UC 纏綿難愈，病勢呈復發、緩解、復發的波浪式進程，該特點決定了患者需要長期、反復地對病情進行治療或監控炎癥進展防止惡化[16-17]。UC 給患者的經濟、生理和心理都會帶來不良影響，如何緩解癥狀與預防其復發的問題亟待解決。張天涵等[16]研究認為UC 輕度活動期患者以脾虛濕蘊證為主，其次是大腸濕熱證，再次為脾虛肝郁證；中度及重度活動期患者均以大腸濕熱證為主。而鴉膽子擅長清熱利濕涼血解毒，適用于UC 的主要證型。盛英麗[18]對150 例UC活動期患者進行隨機對照實驗，驗證了鴉膽子油口服乳液保留灌腸對于UC 有明顯的治療作用。臨床研究證實鴉膽子對UC 有治療作用，但其作用機制鮮有報道。而現代對于鴉膽子的研究多集中于其抗腫瘤作用上，較少關注鴉膽子治療痢疾這一傳統應用[19]。因此，利用網絡藥理學方法分析并探索鴉膽子治療UC的作用機制，可為其進一步的研究及臨床應用提供一定的理論指導。

表2 “通路-靶點”表

圖5 成分-疾病-潛在靶點-通路網絡圖

3.2 鴉膽子主要藥效成分分析

本研究發現木犀草素、亞油酸、棕櫚酸等可能為主要的藥效成分。木犀草素是一種天然四羥基黃酮化合物，具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等[20]。亞油酸具有防癌抗癌、抗粥狀動脈硬化、參與脂肪分解與新陳代謝、增強機體免疫能力等作用，屬于人體必需脂肪酸[21]。棕櫚酸屬于飽和脂肪酸，可通過損傷線粒體氧化呼吸鏈的正常功能，導致細胞發生氧化應激反應[22]。研究結果示鴉膽子在治療UC 的過程中，木犀草素主要通過作用于PTGS2、AKT1、MMP9、TERT 等關鍵靶點發揮作用，亞油酸主要影響PTGS2、IL6、MMP2、TERT、NOS2等關鍵靶點發揮作用，棕櫚酸主要影響TERT、ABCB1 等靶點發揮作用。以上靶點參與炎癥反應、氧化作用、癌癥等，與主要藥效成分抗炎、抗氧化及抗癌作用相關聯。李越等[23]研究表明木犀草素可能是通過激活Nrf2 信號通路，增強小鼠結腸抗氧化活性、抑制促炎因子TNF-α、IL-6 表達，緩解由葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠UC。Chen 等[24]研究顯示木犀草素能夠抑制小鼠巨噬細胞分泌TNF-α等促炎因子，從而減輕UC 的炎癥反應。且有研究證實木犀草素對結腸癌HT-29 細胞增殖、遷移及上皮間質轉化具有抑制作用[25]，說明木犀草素能夠控制UC 進一步發展為癌癥，還可以有效抑制結腸癌的發展和轉移。覃一楓等[26]通過代謝組學研究發現調節亞油酸可以減輕伊立替康所致腸炎的小鼠的炎性癥狀。馬清林等[27]發現棕櫚酸可能是烏梅丸治療UC 的主要藥效物質基礎。通過網絡藥理學技術預測得出的潛在藥效成分與現有實驗研究結果相符，可為鴉膽子有效成分的深入研究和應用提供參考。

3.3 潛在靶點及KEGG通路分析

鴉膽子治療UC 可能是通過IL6、STAT3、AKT1、EGFR、HIF1A 等多個靶點以及HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、AGE-RAGE 信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥通路（Pathway in cancer）等多個通路發揮作用。

3.3.1 潛在靶點分析

白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）是細胞因子核心成員，是UC發展過程中的關鍵因子[28]。IL-6主要通過“反式傳導信號”誘導STAT3 磷酸化，激活轉錄因子NF-κB（Nuclear factorκB）信號通路，NF-κB 從細胞質進入細胞核內，調控炎性細胞因子的表達[29]。目前已有研究發現針對IL-6 或NF-κB 的靶向治療能夠抑制甚至阻斷炎癥的發生[30]。

信號傳導與轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）存在于細胞核內，由Sinapaldehyde 調控參與到抗炎過程中[31]，已被研究證實與UC 發病密切相關[32]。一方面，臨床實驗[33]發現STAT3 被細胞因子激活后發生磷酸化形成磷酸化STAT3（P-STAT3），定位于UC 患者腸道炎癥活動性的區域，此時發現UC 患者體內的STAT3 及P-STAT3 的表達均比健康人升高，且表達水平隨內鏡下及臨床病變活動度的加重逐漸增加。該結果說明了STAT3 不僅是判斷UC 是否存在的依據，更能作為一個動態指標反映UC 的發展階段。另一方面，研究發現[34]STAT3作為一種可介導多種信號通路的轉錄因子，通過調控基因表達會對腸膜上皮Claudin-1 和Occludin 的表達水平產生影響，而Claudin-1和Occludin的表達減少是UC發病及進展的重要分子學基礎，STAT3通過破壞腸黏膜機械屏障的完整性參與了UC 的發病。以上研究證實了STAT3 通過參與炎癥反應及破壞腸道屏障導致UC 的發生，進一步研究對STAT3 的靶向阻斷有助于UC的診治。

AKT1 屬于AKT 激酶的3 種緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，另外2 種為AKT2、AKT3，能夠參與調節代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等過程，該靶點涉及的AKT 信號通路與炎癥反應相關[35]。馬西等[36]通過體外培養結腸癌細胞株HCT-8，測定AKT1 以及其他相關炎癥因子的表達，發現炎癥因子可以通過調控PI3K/Akt 信號通路促進結腸癌侵襲轉移。說明AKT1 在腸道炎癥性疾病以及癌癥轉移等方面都會產生影響，該靶點受到木犀草素等成分的調控，與木犀草素抗炎、抗腫瘤的藥理活性相適應。

3.3.2 KEGG通路分析

晚期糖基化終末產物（Advanced Glycation End Products，AGEs）是在非酶促條件下一些蛋白質、氨基酸、脂質與葡萄糖或其他還原糖經過一系列化學反應形成的；晚期糖基化終末產物受體（Receptor for Advanced Glycation End，RAGE）屬于免疫球蛋白超家族受體[37]。AGE-RAGE 可激活核轉錄因子NF-κB，啟動異常的炎癥反應；亦可誘導氧化應激反應，損害細胞[38]。UC 是以炎癥反應為主的疾病，激活AGERAGE 信號通路則可以通過激活炎癥反應和氧化應激反應，促進UC發生發展。

HIF-1 信號通路主要依靠HIF-1 發揮作用。缺氧誘導因子-1（HIF-1）異質二聚體由2 個亞基：HIF-α（HIF-1α或HIF-2α）和HIF-1β構成[39]，是細胞適應低氧脅迫的關鍵轉錄因子。UC 發生時會使腸道處于低氧甚至缺氧狀態，細胞出現氧化應激，導致氧自由基及相關代謝產物堆積，對細胞產生毒性損害；且氧化應激使氧化劑與抗氧化劑失衡，損傷腸黏膜[30]。Sun M等[40]證明了HIF-1α能夠調節腸道炎癥和維持粘膜內穩態；Higashiyama M 等[41]闡明了缺氧是通過HIF-1α依賴調節細胞因子平衡來控制腸道炎癥。這些研究說明了通過誘導HIF1A（HIF-1α）靶點，激活HIF-1 信號通路，有助于控制炎癥。

3.4 小結

綜上所述，網絡藥理學研究表明中藥鴉膽子治療潰瘍性結腸炎是具有多成分-多靶點-多通路協同作用的特點，且預測得出的結果與現有研究報道中相一致，可從一定程度上為臨床實際應用提供參考。研究發現鴉膽子通過其有效成分，干預潰瘍性結腸炎發展的關鍵靶點及通路，減緩疾病的發展，提示我們可對鴉膽子進行更加全面的綜合開發和深入研究。然而本研究僅是基于數據庫和文獻預測得出的結果，尚需要進行系統的實驗驗證。