基于網絡藥理學和分子對接探討鉤藤-全蝎藥對治療支氣管哮喘的作用機制＊

王國玉，渠 源，陳亞飛，賈新華

（1. 山東中醫藥大學第一臨床醫學院 濟南 250011；2. 山東中醫藥大學中醫學院 濟南 250011；3. 北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029；4. 山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250011）

支氣管哮喘（Bronchial asthma，BA，以下簡稱哮喘）是一種常見慢性氣道過敏性病變，全世界約有4.2%的人患有哮喘[1]，在我國該病的發生率呈逐年上升趨勢[2]。哮喘臨床主要表現為反復喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，與氣候、運動、呼吸道感染或藥物等因素相關，常在夜間癥狀發作或加重，好發于有哮喘家族史、肥胖、吸煙、變應原暴露及有過敏性鼻炎等并發癥的人群。目前認為該病發病機制與氣道炎癥、氣道高反應、氣道重塑、變態反應、神經調節機制等多因素參與相關[3]。西醫治療多使用糖皮質激素、白三烯調節劑、β2受體激動劑、抗膽堿能及茶堿類藥物，但部分患者對激素使用治療依從性較差，且西藥治療存在一定程度的不良反應。

“鉤藤-全蝎”藥對是導師治療哮喘的常用藥對，臨床療效顯著。鉤藤，味甘，性涼，歸肝、心包經，具有清熱平肝、息風定驚的功效；全蝎味辛，性平，歸肝經，具有息風鎮驚、攻毒散結、通絡止痛之用，兩者配伍辛甘發散，相須為用，可增強息風止痙、通絡止痛之效?，F代藥理學表明鉤藤堿具有降壓、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、改善血小板聚集及保護腦缺血缺氧等作用[4-5]；王盟等人實驗發現鉤藤堿固體納米?？赡芡ㄟ^抑制TGF-β1 所誘導的Smad、MAPK 通路起到對哮喘的緩解作用[6]，同時鉤藤可有效延長豚鼠哮喘發作的潛伏期[7]；全蝎具有鎮痛抗炎、抗腫瘤、抗驚厥、抗凝、提高免疫力等作用[8]，然而有關鉤藤-全蝎藥對治療哮喘的具體作用機制未見相關報道。網絡藥理學是基于系統生物學、網絡生物學、多向藥理學、計算生物學等，利用多種數據分析工具，構建疾病-靶點-藥物的多層次關系網絡，解析藥物與疾病間關系的一門融合類交叉學科[9]。中藥多靶點、多組成、多功效的特點與所治療疾病的復雜對應關系正適合通過網絡藥理學進行構建與闡釋[10]。本文主要基于網絡藥理學和分子對接技術分析鉤藤-全蝎藥對藥物活性成分、預測靶點及其可能的分子作用機制，探求鉤藤-全蝎藥對對哮喘治療的具體機制，為中醫藥臨床治療哮喘提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件

Excel 2014 軟件；Cytoscape 3.7.2 軟件；R 軟件；中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/）；中藥綜合數據庫（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）；Uniprot（http://www. uniprot. org/）；人 類 孟 德 爾 遺 傳 網（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/）；GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org/）；Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）；Venny2.1繪制韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）；Open Babel 2.3.2 軟件；Protein Data Bank 數據庫（https://www.rcsb.org/）；Pymol 2.3.4 軟 件；Autodock 4.2.6 軟件；Autodock vina 1.1.2 軟件；omicshare 軟件、GraphPad Prism 8.3.0軟件進行可視化處理。

1.2 鉤藤-全蝎藥對成分及靶點搜集

以“鉤藤”為關鍵詞，在TCMSP數據庫檢索對應的成分，根據吸收、分布、代謝、排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）的藥動學特性參數篩選活性成分。其中以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件。其中以“全蝎”為關鍵詞，通過在TCMID 數據庫上搜集其成分（TCMSP 數據庫未收錄全蝎）。將所得到的成分通過TCMSP數據庫進行靶點提取，并通過Uniprot數據庫校正。

1.3 構建鉤藤-全蝎藥對成分-靶點網絡

將鉤藤-全蝎藥對活性成分和靶點的信息導入Cytoscape 軟件中，進行可視化成分-靶點網絡并分析。節點度的大小表示網絡中該節點與其他節點相連邊的條數，節點度越高在網絡中起到的作用越大，用節點的重要程度篩選鉤藤-全蝎藥對中的重要活性成分。

1.4 哮喘靶點搜集

以“asthma”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫中搜索疾病靶點，結果去重后經Uniprot數據庫標準化校正。

1.5 鉤藤-全蝎藥對和哮喘共有靶點的篩選及PPI 網絡構建

篩選鉤藤-全蝎藥對和哮喘的共同靶點，結果使用R 軟件可視化。將共有靶點信息上傳至String 數據庫進行網絡構建，將得到的靶點信息提交至Cytoscape軟件中呈現，同時將所得的節點度進行分析后，通過節點顏色和大小呈現。

1.6 鉤藤-全蝎藥對和哮喘共有靶點富集

哮喘和鉤藤-全蝎藥對的共同靶點在David 軟件進行GO 和KEGG 潛在靶點富集分析，篩選KDR（Q值）＜0.05 的前20 名生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）、細胞組分（Cellular component，CC）和KEGG 通路，其中KDR 值越小，代表該生物過程或通路與鉤藤-全蝎藥對治療哮喘的關系越密切，最后通過omicshare 軟件進行可視化處理。

1.7 構建鉤藤-全蝎藥對和哮喘的“化合物-靶點-通路-疾病”網絡

以選取鉤藤-全蝎藥對與哮喘共同的靶點基因，靶點基因涉及的重要通路，針對共同靶點基因的活性成分，疾病和藥物名稱這4 個方面為節點，在Excel 表格中整理化合物、靶點、通路、疾病、藥物之間的對應關系并導入到Cytoscape 軟件中，構建并分析鉤藤-全蝎藥對“化合物-靶點-通路-疾病”的網絡藥理圖。

1.8 分子對接

分析選擇PPI 網絡中連接度值最高的7 個靶點，認為這7個靶點是藥物治療支氣管哮喘疾病的關鍵靶點基因。選取鉤藤-全蝎藥對中關鍵活性成分，下載其化合物結構文件，并利用Open Babel 軟件將MOL2文件轉化為PDB 文件，將其作為配體；在Protein Data Bank查找相應受體蛋白，下載蛋白結構；使用Pymol軟件和Autodock 軟件對蛋白進行處理，采用Autodock vina 進行分子對接，結合能（Affinity）小于-5 kcal·mol-1表明結合活性較好，數值越小說明藥物小分子與靶蛋白受體結合越穩定。

表1 鉤藤-全蝎藥對成分

2 結果

2.1 鉤藤-全蝎藥對成分及靶點信息

通過TCMSP 數據庫搜索，根據設定ADME 篩選標準納入鉤藤成分33 個；通過TCMID 數據庫，納入全蝎成分4個，其中taurine、trimethylamine 藥物相似性雖未到篩選要求，但考慮其口服生物利用度較高，故納入其中（表1）。篩除重復項后，鉤藤-全蝎藥對共有37種成分，234個靶點。

2.2 鉤藤-全蝎藥對成分及靶點網絡

將鉤藤-全蝎藥對成分和靶點導入Cytoscape軟件后，軟件顯示（圖1、表2）：Degree 前5 的成分分別是：槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、育亨賓堿（yohimbine）、甲基（E）-2-[(2S,3Z,12bS)-3-亞乙基-2,4,6,7,12,12b-六氫-1H-吲哚并[3,2-h]喹諾嗪-2-基]-3-甲氧基丙-2-烯酸酯（methyl (E)-2-[(2S,3Z,12bS)-3-ethylidene-2,4,6,7,12,12b-hexahydro-1H-indolo[3, 2-h]quinolizin-2-yl] -3-methoxyprop-2-enoate），Degree 分 別 為：78、35、17、16、16。

圖1 鉤藤-全蝎藥對活性成分-靶點圖

2.3 哮喘靶點信息

經過搜索后，在GeneCards 數據庫中獲得5973 個靶點，OMIM 數據庫中獲得43 個靶點，經去重、標準化處理后，得到哮喘相關靶點6010個。

2.4 鉤藤-全蝎藥對和哮喘共有靶點網絡

將鉤藤-全蝎藥對和哮喘靶點導入Venny軟件，篩選共有靶點，并使用韋恩圖呈現（圖2）。將共有靶點上傳到String 數據庫得到靶點間相互作用關系，輸出關系信息提交到Cytoscape 軟件中呈現（圖3），核心網絡圖包括89 個節點，748 條邊，平均度值為16.8，超過平均度值的有35 個，推測這35 個靶點是鉤藤-全蝎藥對作用于哮喘的關鍵靶點，并將其做成柱狀圖（圖4），并刪選Degree≥16.8 的節點。通過刪選，鉤藤-全蝎藥對和哮喘共有靶點Degree 值前7 個靶點是IL6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、FOS、MAPK8（ 圖3、圖4）。

表2 關鍵活性成分的基本信息

2.5 共有靶點富集分析

GO 富集分析結果顯示，生物過程主要包括對有機物質的反應、對化學物質的反應、細胞對有機環的反應、細胞對化學刺激的反應、信號傳導過程、細胞通訊過程等方面；分子功能主要涉及相同的蛋白質結合、蛋白質二聚活性、離子結合、雙鏈DNA 結合、酶結合、類固醇結合等方面；細胞組分主要與膜封閉腔、細胞器管腔、細胞內細胞器管腔、細胞質部分等有關（圖5-圖7）。信號通路主要涉及癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol-3-kinsae，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB）信號通路（又稱PI3K/Akt 信號通路）、松弛素信號通路、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、C型凝集素受體信號通路、催乳素信號通路、癌癥中的小分子RNA、癌癥蛋白聚糖、內分泌抵抗等方面，同時與人類巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙肝、乳腺癌等感染類疾病和癌癥密切相關（圖8）。

2.6 鉤藤-全蝎藥對和哮喘的“化合物-靶點-通路-疾病”網絡

利用Cytoscape 軟件可視化鉤藤-全蝎藥對的“化合物-靶點-通路”網絡。網絡圖直觀地呈現了37種鉤藤-全蝎藥對活性成分、89個鉤藤-全蝎藥對和哮喘疾病的共同靶蛋白、26 條共同靶蛋白作用通路和哮喘之間關聯，體現了作用靶點分布于不同的代謝通路，相互作用，共同影響鉤藤-全蝎藥對治療哮喘（圖9）。

圖2 哮喘和鉤藤-全蝎藥對靶點韋恩圖

圖3 哮喘和鉤藤-全蝎藥對共有靶點PPI網絡

2.7 分子對接

采用分子對接的方法，選取核心靶點IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、FOS、MAPK8與鉤藤-全蝎藥對關鍵成分槲皮素、山奈酚、育亨賓堿、β-谷甾醇、甲基（E）-2-[(2S,3Z,12bS)-3-亞乙基-2,4,6,7,12,12b-六氫-1H-吲哚并[3,2-h]喹諾嗪-2-基]-3-甲氧基丙-2-烯酸酯進行對接，從PDB 數據庫中檢索獲得受體蛋白CASP3（PDBID: 2J32）、EGFR（PDBID: 6S9C）、ESR1（PDBID: 6VJ1）、FOS（PDBID: 1FOS）、IL6（PDBID:1ALU）、MAPK8（PDBID: 2XRW）、VEGFA（PDBID:1VPF），通過計算受體-配體復合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評估其親和力，最終給出親和能打分，這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標，能值越低，二者的結合效果越好（圖10）。

育亨賓堿與受體蛋白CASP3、MAPK8及槲皮素與受體蛋白ESR1、IL6分別結合，β-谷甾醇與EGFR 相結合（圖11）。圖A 為CASP3 與育亨賓堿相結合，氨基酸殘基Ser209、Asn208 與育亨賓堿配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Arg207、Ser205、Tyr204、Phe256、Trp206、Phe250與配體小分子形成疏水相互作用；圖B為EGFR 與β-谷甾醇結合模式，氨基酸殘基Lys745、Glu762與β-谷甾醇配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘 基Phe723、Val726、Met790、Leu718、Leu792、Gly796、Asp800、Cys797、Met793、Leu844、Thr854、Asn842、Asp855 與配體小分子形成疏水相互作用；圖C 為IL6 與槲皮素結合模式，氨基酸殘基Asp34、Gln175、Arg179 與槲皮素配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Leu33、Leu178、Arg30 與配體小分子形成疏水相互作用；圖D 為ESR1 與槲皮素配體小分子之間的結合模式，氨基酸殘基Arg394、His524 與槲皮素配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘Leu349、Glu353、Ala350、Leu387、Leu384、Met421、Ile424、Phe425、Leu428、Leu404、Leu391 與配體小分子形成疏水相互作用；圖E為MAPK8與育亨賓堿之間的結合模式，氨基酸殘基Ser34 與育亨賓堿配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Lys55、Val40、Ala53、Met111、Val158、Asn114、Leu168、Ser155、Asp169、Lys153、Asn156、Gly35與配體小分子形成疏水相互作用。

圖4 PPI網絡中節點度大于平均值的共有靶點

圖5 鉤藤-全蝎藥對活性成分對應潛在靶標的BP分析

3 討論

圖6 鉤藤-全蝎藥對活性成分對應潛在靶標的MF分析

圖7 鉤藤-全蝎藥對活性成分對應潛在靶標的CC分析

支氣管哮喘屬于中醫“哮病”之范疇，臨床上多表現為發作性的痰鳴氣喘，發時喉中有哮鳴音，呼吸氣促困難，甚則喘息不得平臥。哮喘的病因如《癥因脈治·哮病》所言：“哮病之因，痰飲留伏，結成窠臼，潛伏于內，偶有七情之犯，飲食之傷，或外有時令之風寒束其肌表，則哮喘之癥作矣”，認為其發病因素與外感六淫、內傷七情、飲食勞倦等有關，其中病理因素以痰為主，與肺脾腎三臟對津液運化、布散、輸布失常密切相關。哮喘發病存在反復性、發作性、季節性發作等特點，與伏邪的致病特點相似，大抵為痰阻肺絡及較為細小的絡脈中，受風邪為主的外感六淫邪氣影響，伏而發病，同時與瘀、熱、寒等病理因素相關。治療上朱丹溪在《丹溪心法·哮喘十四》提出“哮喘必用薄滋味”的用藥經驗，早在《素問·陰陽應象大論》中便提到“味厚者為陰，薄為陰之陽。氣厚者為陽，薄為陽之陰……味厚則泄，薄則通”“辛甘發散為陽，酸苦涌泄為陰”，認為薄味具有通達宣暢的作用，而后李東垣在《脾胃論》中提出“陽本根于陰，惟瀉陰中之火，味薄風藥，升發以伸陽氣，則陰氣不病，陽氣生矣”，提出“味薄風藥”的概念。結合哮喘的病因病機，筆者認為支氣管哮喘急性發作期在治療時應在化痰的基礎，加用祛風通絡類藥物，如鉤藤、全蝎之類，屬于辛、甘類藥物，《本草便讀》中記載，全蝎“走臟腑，行經絡”，“凡藤類之所屬，皆可通經入絡”，可有效改善脈絡絀急氣逆的病理狀態，對哮喘發作時的氣管痙攣狀態有較好的緩解作用，臨床應用療效顯著。

圖8 鉤藤-全蝎藥對活性成分對應潛在靶標的KEGG富集分析

根據中藥“活性成分-靶點網絡”分析，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、育亨賓堿等很可能是關鍵作用成分。其中槲皮素可抑制白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α等氣道炎癥介質的分泌，降低肺組織NOD 樣受體家族3（NOD-like receptors，NLRP3）、脂肪干細胞（Adipose-derived stem cell，ASC）、胱冬肽酶-1（Caspase-1，CASP1）的蛋白表達，減少血中嗜酸性粒細胞和IgE 的表達，升高干擾素γ的水平，從而改善支氣管哮喘氣道炎癥，其機制可能與miR-155 或氣道上皮Toll 樣受體-4（Toll-like receptors-4，TLR4）/核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達下調有關[11-15]；山奈酚可以通過干預MAPK、PI3K 等信號通路的表達調節炎癥介質的表達，減少相關炎癥因子的分泌，調控促炎酶活性的活性，從而有效抑制炎癥的產生[16]，或可通過干擾NF-κB 信號傳導抑制氣道上皮細胞的嗜酸性粒細胞浸潤和氣道炎癥[17]；β-谷甾醇可能通過抑制細胞反應和隨后的Th2細胞因子釋放以抑制哮喘，同時降低TNF-α、IL-4、IL-5 等細胞因子的水平[18]。

圖9 鉤藤-全蝎藥對與哮喘的“化合物-靶點-通路-疾病”網絡模型

圖10 分子對接結果

PPI蛋白互作網絡結果顯示IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、MAPK8 可能是鉤藤-全蝎藥對治療哮喘的關鍵靶點。支氣管哮喘主要是由于嗜酸性粒細胞增多、浸潤所引起的一種病理改變，同時與嗜酸性粒細胞正常凋亡受到抑制密切相關，臨床試驗表明支氣管哮喘病人的血清和痰液中IL-6 的水平明顯提升[19]，而IL-6 主要通過IL-6/mIL-6R 信號通路、和IL-6/sIL-6R 復合物信號信號通路促進IL-4和IL-13的產生，從而加重氣道炎癥的同時抑制Treg 細胞，促進其他免疫反應的發生[20]。先前的實驗中發現在哮喘過程中，氣道上皮細胞表達高水平的EGFR，參與免疫應答和細胞重塑過程[21,22]，實驗證明表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）在哮喘氣道平滑肌細胞中被內皮素-1激活，并參與哮喘的氣道重塑[23]。哮喘的性別差異可能與性激素的分泌有關，尤其是雌激素受體1（Estrogen Receptor 1，ESR1）基因的表達與變異，高水平的ESR1 表達可能有抗炎作用，可以有效抑制氣道炎癥[24]，且有試驗證明雌激素具有抑制肺成纖維細胞的增殖的作用[25]。絲裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）即JNK，在哮喘的凋亡過程和氣道重塑中具有顯著作用[26]。

圖11 分子對接結合模式

KEGG 富集分析結果顯示，鉤藤-全蝎藥對主要通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1）信號通路、MAPK信號通路、NF-κB 信號通路等來治療哮喘。PI3K-Akt信號通路參與支氣管哮喘的炎癥、變態反應、氣道重塑等多種病理過程，受轉化生長于因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）、IL-25、炎 癥 區 域1（Found in inflammatory zone 1，FIZZ1）等多種酶、細胞、基因片段的調控，其可影響炎癥的增殖、聚集、活化、凋亡的調節，從而影響支氣管哮喘發病[27,28]；實驗研究也證實，通過對PI3K 信號進行干預可有效地抑制支氣管哮喘的發生發展[29,30]。TNF 信號通路介導多種細胞內信號通路，包括細胞凋亡，細胞存活以及炎癥和免疫反應，其TNF 作為其中的重要細胞因子，研究發現TNF-α對氣道平滑肌有直接作用，且增加嗜酸性細胞對內皮細胞的細胞毒性作用，參與T細胞的激活，增加粘附分子的上皮表達等促進氣道炎癥和氣道高反應[31-33]，有研究發現將TNF-α作為治療哮喘的靶點在臨床試驗中有明顯療效[34]。HIF-1 信號通路可以激活幾種炎癥細胞因子、趨化因子和生長因子的轉錄，以及基質重塑蛋白（如膠原蛋白酶和基質金屬蛋白酶），從而參與氣道炎癥和氣道重塑[35]。MAPK 信號通路主要調節細胞增殖、凋亡、分化，調控機體炎癥和免疫等方面，從而介導免疫/炎癥細胞反應、氣道結構細胞反應，調控Th1/Th2 比例影響其免疫應答過程參與支氣管哮喘的形成和發展；有研究表明通過對該通路進行干預可有效改善氣道重塑，抑制嗜酸性粒細胞在支氣管黏膜下的浸潤，對哮喘起到治療作用[36]。NF-κB 信號通路主要是在細胞分化、凋亡，調節機體防御、組織損傷應激中起到信息傳遞作用，可以通過調控IL-1、TNF-α等促炎因子、黏附因子、生長因子和血管生成因子的轉錄過程及表達影響支氣管哮喘的發作[37]；有研究表明通過阻斷或抑制其信號傳導過程可起到減少細胞因子和趨化因子的產生，拮抗哮喘發作時的氧化應激狀態，從而達到對哮喘治療的目的[38,39]，所以看出該信號通路不僅與哮喘的氧化應激有關，同時在氣道重塑和氣道炎癥形成中關系密切。

分子對接顯示，鉤藤-全蝎藥對的活性成分與CASP3、MAPK8、ESR1、IL6、EGFR 具有較好的親和力，但其化合物治療哮喘的活性需要進一步生物實驗驗證。

本研究通過網絡藥理學的方法對鉤藤-全蝎藥對治療支氣管哮喘的潛在靶點和機制進行預測，使用分子對接技術對其進行進一步驗證，初步結果證實了鉤藤-全蝎藥對通過槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、育亨賓堿等活性成分作用于IL-6、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK8等靶點治療支氣管哮喘的可行性，具有一定的可靠性，為進一步探討其具體作用機制提供了新思路。但結果也需進一步的基礎和臨床實驗驗證。