基于網絡藥理學對黃連抗結直腸癌作用機制的分析＊

王與菲，張海婧，吳練秋

（中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室 北京 100050）

黃連是一味古老的抗菌藥物，主要功能為清熱燥濕、瀉火解毒。近年來黃連素藥效逐漸被挖掘，并已西藥化，其在治療心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板聚集[1]及抗腫瘤[2]方面有一定的療效。作為傳統中藥，黃連也因具有治療腹瀉的作用而被廣泛應用于臨床[3-4]，有臨床研究表明，黃連堿對降低結直腸腺瘤復發風險安全有效，可作為息肉切除術后化療預防的一種選擇[5]，它具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的藥理學特點[6]。黃連及其有效成分小檗堿和黃連堿等已被證實具有一定的抗結直腸癌作用[7-10]，通過誘導結腸癌細胞G0/G1 期細胞周期阻滯而抑制細胞增殖[11]，同時可誘導多種腫瘤細胞凋亡，如結腸癌細胞[12]、卵巢癌細胞[13]等。

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）約占全世界每年診斷出的所有癌癥和癌癥相關死疾病的10%[14]。它是女性第二常見的癌癥，男性第三常見的癌癥。CRC發病率和死亡率在全球范圍內呈上升趨勢，特別是在經濟發達國家發病率最高[15]，近年來我國結直腸癌的發病率和死亡率也逐年升高。結直腸癌屬于常見的消化系統惡性腫瘤，其惡性程度高、進展快、長期生存率低[16]。考慮到該疾病晚期才出現癥狀以及傳統的手術療法使CRC 生存預后較差，因此，早期發現CRC 并發現治療CRC 的新藥物、提高結直腸癌的治療效果，是目前中醫藥領域的重要研究課題。中醫藥對于結直腸癌的認識歷史久遠，在整體觀念和辨證論治思想指導下能夠參與結直腸癌的全程治療[17]，對于控制病情進展、減輕癌癥放化療不良反應、提高患者生存質量等方面具有明顯優勢，能夠在整體治療過程中起到至關重要的作用[18-19]，中草藥作為在中國臨床常用的補充和替代療法，能有效減少放療、化療帶來的毒副作用，改善患者免疫功能，減少術后復發及轉移[20]。

網絡藥理學利用網絡拓撲結構分析及生物信息學方法來解釋藥物、靶點、信號通路與疾病之間的復雜關系，為研究中藥復方作用機理及臨床研究提供了新思路[21]。結直腸癌的病理機制復雜，單一基因突變或信號通路的改變無法全面解釋結直腸癌的發生機制。基于網絡藥理學的“藥物-靶點-疾病”相互作用網絡，有助于系統揭示黃連通過多成分、多靶點、多途徑抗結直腸癌的作用機制，本文將采用網絡藥理學分析方法探討黃連抗結直腸癌的物質基礎和作用機制，希冀為臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 黃連化合物成分篩選

基于中藥系統藥理學數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[22]和中醫藥整合藥理學研究平臺（http://www.tcmip.cn）[23]檢索黃連的主要化學成分。同時通過PubMed 文獻[24]分析，對黃連的活性成分進行補充，并利用PubChem 數據庫對檢索得到的化合物成分進行結構驗證，獲取化合物簡化分子線性輸入系統（Simplified Molecular Input Line Entry System，SMILES）結構式。

1.2 黃連抗結直腸癌化合物靶點預測

將檢索得到的黃連中主要化合物的SMILES 導入SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）[25-26]進行反向分子對接，篩選Probability＞0.5 的可能靶點。同時以“colorectal cancer”為關鍵詞，通 過GeneCards（http://www.genecards.org/）[27]和Open Targets（http://www.targetvalidation.org/）[28]數據庫檢索結直腸癌相關的疾病靶蛋白。將上述數據庫獲取的結直腸癌相關疾病靶點與SwissTargetPrediction 預測得到的黃連主要化合物潛在作用靶點取交集作為黃連治療結直腸癌的潛在作用靶點進行機制探討。

1.3 黃連抗結直腸癌“化合物-靶點”網絡構建及分析

為明確黃連中各活性成分、靶點和疾病之間的關系，將篩選得到的共有靶點與活性化合物對應關系導入Cytoscape 3.8.1 軟件[29]，構建“成分-靶點”網絡圖。采用Network Analyzer 工具進行拓撲分析，對黃連抗結直腸癌的“成分-靶點”網絡的介度（Betweenness centrality，BC）、緊密度（Closeness centrality，CC）以及連接度（Degree）進行研究，遴選關鍵藥效分子和核心靶點。

1.4 黃連抗結直腸癌靶點蛋白互作網絡構建及分析

為進一步了解黃連治療結直腸癌潛在作用靶點的功能和作用機制，將篩選得到的共有靶點導入SRTING 數據庫（https://string-db.org）[30]，物種設定為“Homo sapiens”，對作用靶點進行蛋白互作分析。利用Cytoscape 3.8.1 軟件構建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網絡并采用拓撲學分析各網絡節點的介度、緊密度以及連接度，遴選黃連治療結直腸癌的核心蛋白。

1.5 黃連抗結直腸癌靶點生物功能分析及通路分析

應用R 語言對黃連治療結直腸癌的靶點進行GO（Gene Ontology）[31-32]分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[33]信號通路富集分析，探究黃連治療結直腸癌潛在靶點參與的生物學過程與涉及的信號通路。

2 結果

2.1 黃連化合物成分篩選及靶點預測

通過TCMSP數據庫、TCMIP 數據庫及PubChem 文獻檢索，得到黃連活性化合物成分62 種。應用SwissTargetPrediction 數據庫獲取黃連62 種活性成分對應靶點，對靶點進行查重、剔除無法獲得基因名的蛋白，并與GeneCards 和Open Targets 檢索得到的結直腸癌疾病相關靶點取交集，最終獲得134 對“化合物-靶點”對應關系，共包含91個靶點。

2.2 黃連治療結直腸癌“化合物-靶點”網絡構建及分析

將134 個“化合物-靶點”對應關系導入Cytoscape 3.8.1軟件，構建黃連活性成分治療結直腸癌的“成分-靶點”網絡圖（圖1）。綠色代表活性化合物，粉色代表藥物活性成分與疾病相關靶點的共有靶點，134 條連線表示活性成分對共有靶點的作用。

圖1 黃連抗結直腸癌化學成分-靶點網絡

將“成分-靶點”網絡進行拓撲分析。結果表明，黃酮醇類類（如槲皮素等）和生物堿類（如小檗堿等）作為關鍵藥效分子可能在黃連治療結直腸癌過程中發揮重要作用（表1）。

表1 黃連抗結直腸癌關鍵藥效分子及拓撲參數（前10位）

取前10個靶點為核心靶點。結果顯示，碳酸酐酶（CA12、CA2等）、多巴胺受體2（DRD2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、溶質載體家族6 成員3（SLC6A3）、醛糖還原酶（AKR1B1）等靶點的拓撲參數較高，可能在黃連治療結直腸癌的過程中發揮核心作用（表2）。

2.3 黃連抗結直腸癌靶點蛋白互作網絡構建及分析

將共有靶點導入String數據庫構建PPI網絡圖（圖2）。拓撲分析結果顯示，度值較高的靶點包括蛋白激酶B α（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、熱休克蛋白AA1（HSP90AA1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、磷脂酰肌醇-3 激酶調節亞基1（PIK3R1）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、血管內皮細胞生長因子2（KDR）和微管關聯蛋白τ（MAPT）（表3）。

表2 黃連抗結直腸癌關鍵靶點拓撲分析（前10位）

圖2 黃連作用靶點PPI網絡圖

表3 黃連抗結直腸癌蛋白互作網絡拓撲分析（前10位）

2.4 黃連抗結直腸癌靶點生物功能分析

利用DAVID 數據庫對黃連化合物作用靶點進行GO 生物過程富集分析，設置閾值P＜0.05。研究相關靶點的生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和 分 子 功 能（Molecular Function，MF），選取P值最小的前10 個條目作圖（圖3）。富集度較高的生物學過程主要涉及細胞對化學壓力的反應、細胞對活性氧的反應、細胞對氧化應激的反應、蛋白激酶B 信號傳導、蛋白質自身磷酸化、細胞對藥物的反應。細胞組成中富集度較高的條目主要包括髓鞘、蛋白激酶復合物、轉移酶復合物、突觸前膜、管基底等離子體膜、小窩、細胞膜等。同時黃連抗結直腸癌的作用與碳酸脫水酶的活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、碳氧裂解酶的活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等分子功能密切相關。

圖3 黃連抗結直腸癌核心靶點GO功能富集分析

2.5 黃連抗結直腸癌靶點KEGG通路富集分析

對黃連化合物抗結直腸癌作用靶點進行KEGG通路富集分析，設置閾值P＜0.05。篩選出前30 條通路（圖4）。排名靠前的主要包括PI3K-AKT信號通路、蛋白聚糖途徑、Ras 信號通路、前列腺癌磷脂酶D 信號通路、Rap1 信號通路、ErbB 信號通路、HIF-1 信號通路、FoxO信號通路、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、花生四烯酸代謝途徑等。

3 討論

3.1 黃連治療結直腸癌的有效成分分析

黃連（Coptis chinensis）為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云南黃連的干燥根莖。黃連始載于《神農本草經》，是我國傳統名貴中藥材之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌、抗炎等功效。隨著醫學技術的發展，對黃連的藥理研究不斷深入，發現其對多種癌癥有一定療效[6]。本研究通過對TCMSP和TCMIP數據庫及文獻檢索得到黃連活性成分62種。應用SwissTargetPrediction數據庫獲取黃連62 種活性成分對應靶點，并與GeneCards 和Open Target 檢索得到的結直腸癌疾病相關靶點取交集，最終得到黃連抗結直腸癌相關靶點91個，提示黃連可能主要通過上述靶點發揮抗結直腸癌的藥理作用。

在獲得黃連有效成分的基礎上，構建黃連活性成分-結直腸癌靶點網絡分析，通過拓撲分析發現黃酮醇類類（如槲皮素等）和生物堿類（如小檗堿等）作為關鍵藥效分子可能在黃連治療結直腸癌的過程中發揮重要作用。文獻報道，黃連活性成分小檗堿能夠抑制拓撲異構酶和細胞周期蛋白，活化絲氨酸蛋白酶，誘導細胞色素C釋放，抑制環氧酶-2活性[34]，對惡性膠質瘤C6 細胞的體外增殖具有抑制作用[35]。槲皮素廣泛存在于植物的花、葉和果實中，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、和免疫抑制等藥理學活性[36]。槲皮素還能夠誘導腫瘤細胞凋亡[37]，但對正常細胞無明顯影響[38]。并且槲皮素能夠抗致癌和促癌因子，抑制癌細胞增殖[37,39]。槲皮素還可以通過抗線粒體途徑和激活Caspase 途徑誘導人乳腺癌細胞凋亡，通過EGFR 介導，抑制乳腺腫瘤細胞中MMP9 的分泌而限制腫瘤細胞的侵襲[40]。另有研究表明，槲皮素能夠下調AKT/mTOR/p70S6K 信號通路，進而抑制腫瘤細胞的生長和血管生成[41]。

圖4 黃連抗結直腸癌核心靶點KEGG通路分析

3.2 黃連治療結直腸癌的有效靶標

在獲得共有靶點的基礎上，進行PPI 分析發現，AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9 等作為關鍵靶點可能在黃連治療結直腸癌的過程中發揮重要作用。AKT也被稱為蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB），PI3K 是作用于生長因子信號通路的一種重要調節蛋白，刺激酪氨酸激酶生長因子受體可以激活PI3K，進而激活下游AKT。PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細胞的生長、增殖、生存、凋亡、代謝以及腫瘤耐藥和腫瘤免疫逃逸密切 相 關[42]。激 活PI3K 可 使 下 游AKT 在Ser473 和Thr308 磷酸化生成p-AKT。有研究表明，結直腸癌組織中PI3K 和AKT 的表達明顯高于正常組織。p-AKT在結直腸癌中的表達水平明顯高于腺瘤，且p-AKT 和結直腸癌的分期、術前血清癌胚抗原的水平明顯相關[43]。另外，在腫瘤細胞中MMP9 能夠破壞細胞膜屏障，導致細胞浸潤、游走能力增強。腫瘤轉移主要依靠其血管不斷生成，在腫瘤組織中，高表達的MMP9參與血管的生成，使得腫瘤細胞更加容易轉移到周圍正常組織中，引起產生腫瘤的轉移[44]。

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases，CAs)是鋅金屬酶的一個大家族，它催化二氧化碳的可逆水化，維持pH的穩態[45]。缺氧和細胞外酸中毒是侵襲性實體腫瘤的病理生理特征，細胞內pH 的調節對于維持腫瘤細胞在該微環境中的代謝和增殖至關重要[46]。這表明CAs在許多類型的癌癥中有重要作用。有文獻表明，CA1在結直腸癌中表達降低[47]，核轉錄因子IC（Nuclear factor IC，NFIC）是CA1 的上游因子[47]，這意味著NFIC可以通過調控CA1 的功能在治療結直腸癌中發揮作用。碳酸酐酶9（Carbonic anhydrases，CA9）是收到缺氧誘導因子（Hypoxia-inducing factor，HIF）調控最強烈的蛋白之一，參與了氫離子濃度指數（Hydrogen ion concentration，pH）的調控[48]。CA9-ko 在缺氧條件下顯著抑制腫瘤細胞的生長。異種移植瘤實驗顯示CA9-ko 可以顯著降低腫瘤的體積大小[49]。CA12 的顯著誘導發生在Na+/H+交換泵（Na+/H+exchanger isoform-1，NHE1）/CA9-dko 腫瘤中，表明這是一種彌補pH 調節蛋白損失以維持生長的潛在手段。CA9 被認為是一種可誘導缺氧的蛋白，研究表明，CA9 的表達與結直腸癌的發生和侵襲有關，控制細胞內外的pH 值，導致不良預后。在結直腸癌中，CA2 的表達可能被抑制，而CA9 可能表達上調，并且CA9 在晚期結腸炎相關結腸 癌（Ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCCA）中表達顯著升高[50]。

AKT1 基因的多態性會影響癌細胞的新輔助化療的敏感性[51]，有研究顯示，p53/miR-374b/AKT1 信號在人結腸癌細胞HCT116 的凋亡中發揮重要作用，可以應對博來霉素（Bleomycin，BLM）誘導的DNA 損傷[52]，這意味著調控這些因素可能提高結直腸癌細胞對化療的敏感性。在結直腸癌患者體內，AKT1 的高表達水平與生存率顯著相關[53]。敲除AKT1 可顯著抑制結腸癌細胞遷移和侵襲，在體內外結腸癌中顯著增加上皮鈣粘蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）表達，降低 神 經 鈣 粘 蛋 白（Neural-cadherin，N-cadherin）、phospho(p)-AKT1、磷酸化糖原合酶激酶3β（Phosphoglycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）和Snail 的表達。因此，AKT1 可能是結腸癌細胞的關鍵調控因子，也是該疾病的潛在治療靶點[54]。

使用抗表皮生長因子受體（Anti-epidermal growth factor receptor，anti-EGFR）抗體治療轉移性結直腸癌（Metastatic colorectal cancer，mCRC）可以改善患者預后，特別是針對預測性生物標志物選擇缺乏RAS 突變的患者[55]。治療mCRC 患者唯一確定的生物標志物就是腫瘤RAS 突變狀態，這是抗EGFR 治療的陰性預測標志物[56]。西妥昔單抗和帕尼單抗都是針對EGFR 的胞外結構域的單克隆抗體，該結構域阻斷配體結合并抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK 信號通路，從而治療野生型RAS轉移型結直腸癌[57]。

PTGS2 產生炎癥介質前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2），并促進結直腸癌的發展。在結直腸癌患者中，PTGS2 表達可能會增加腫瘤復發風險，并且和較差的特異性結直腸癌生存期有關，但與總生存期無關[58]。

SRC 在超過80%的結直腸癌患者中異常過表達和激活，SNX10（Sorting nexin 10）在人結直腸癌組織中的顯著下調，上調SNX10 的表達來調控SRC-STAT3和SRC-CTNNB1 信號通路的活性[59]。有文獻表明，SRC 是Cten 信號通路中一個新的重要的功能靶點，Cten 蛋白在轉錄后穩定SRC 促進結直腸癌上皮間質轉化和轉移[60]。因此，SRC 可能成為未來發展的潛在治療靶點。

3.3 黃連治療結直腸癌的關鍵通路分析

GO分析及KEGG通路富集結果顯示，共有靶點主要富集在PI3K-AKT 信號通路、蛋白聚糖途徑、Ras 信號通路、前列腺癌磷脂酶D 信號通路、Rap1信號通路、ErbB 信 號 通 路、HIF-1 信 號 通 路、FoxO 信 號 通 路、VEGF信號通路、花生四烯酸代謝途徑等多條通路中。

PI3K/AKT/mTOR 通路與結直腸癌發展密切相關，并且mTOR 通路成分在結直腸癌中過表達[61]。PI3K/Akt/mTOR 信號在結腸上皮細胞中發揮重要作用，它調節細胞對葡萄糖和各種氨基酸的反應，以及對各種細胞外信號的反應。研究證實Akt通過抑制不同亞型Akt1 和Akt2 在結腸癌中的作用，從而降低腫瘤的生長[62]。PI3K/mTOR通路的抑制劑已成功用于原發性和轉移性結直腸癌的治療，例如，南蛇藤醇通過PI3K/AKT 信號通路抑制MMP3 和MMP7，抑制結直腸癌細胞增殖和遷移[63]，有研究證實，在結腸癌的異種移植小鼠模型中，過表達二型肌苷單磷酸脫氫酶（Inosine monophosphate dehydrogenase type II，IMPDH2）可通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路促進G1/S 期細胞周期轉變，促進細胞侵襲、遷移和上皮-間充質轉化（Epithelialmesenchymal transition，EMT），加速裸鼠異種移植瘤的生長，在結直腸癌細胞和組織中，IMPDH2 在mRNA 和蛋白水平均上調，與CRC 患者生存差顯著相關[64]，使該通路成為臨床癌癥治療的一個有前景的靶點。PI3K/AKT/mTOR 信號通路與結腸癌細胞的發生、轉移、耐藥和干細胞特性有關[65]，從而使該通路成為藥物治療的首選靶點。在各種臨床前和臨床模型中，各種天然和合成分子被證明可以抑制結腸癌，這些抑制劑作為臨床抗癌藥物的潛力。

基于典型突變的分類和最近的轉錄組的分類中普遍認為RAS 突變在結直腸癌的發病機制中起著核心作用[66]。有研究表明，在76%的原發性CRC 病變中發現RAS 突變[67]，RAS 可激活不同信號通路的下游效應器，主要激活PI3K-AKT 信號通路和級聯組成RAF激酶，它激活促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogenactivated protein kinase，MEK1）和MEK2，以及隨后激活細胞外信號調控激酶1 和2（Extracellular signalregulated kinases，ERK1 和ERK2），促進細胞生存、增殖、入侵和遷移[68-69]。RAS 突變狀態被用來預測轉移性結直腸癌患者對抗表皮生長因子受體藥物的耐藥性[53]。大約40%的結腸直腸癌發生KRAS 突變，在結直腸細胞惡性轉化的早期以及轉移性結直腸癌的晚期都KRAS 突變都發揮了關鍵作用[70]，因此，RAS 被認為是診斷和預后人類惡性腫瘤的新的潛在生物標志物。

CRC 患者腫瘤中RAP1 表達較高，RAP1 參與代謝相關通路的調控，轉錄調控基因在細胞粘附和腫瘤進展中發揮作用[71]。與相鄰正常組織相比，乳腺腫瘤組織中RAP1表達水平顯著升高，提示RAP1可能在腫瘤進展中發揮作用[72]。數據分析還發現RAP1 的高表達與結直腸癌的預后不良有關[73]，但是在CRC 放療耐藥中的作用仍是未知的。Rap1 GTP 酶激活蛋白是Rap1活性的負調節因子，其下調與結直腸癌的預后不良有關，并可能影響腫瘤進展[74]。在結直腸癌病例中，Rap1GAP表達與MMP-9呈負相關，與E-cadherin呈正相關[75]。Rap1 可能參與CRC 的腫瘤進展，并可能成為結直腸癌患者預后預測的潛在靶點。

結直腸癌患者血清中VEGF、MMP-2 的表達與腫瘤浸潤深度、Dukes 分期、結直腸癌肝轉移（Colorectal liver metastasis，CLM）、淋巴結轉移有關[76]。在多個結直腸癌細胞系中，細胞內VEGF 和VEGFR1 的缺失強烈抑制了結直腸癌細胞遷移和侵襲[77]。貝伐珠單抗（Bevacizumab/Avastin）是血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的重組人源化單克隆抗體，2004年首次被食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準作為治療轉移性結直腸癌的抗血管生成藥物[78]。有研究表明，CRC 患者門靜脈血清VEGF、MMP-2 水平可作為判斷CRC 預后和預測CLM 的有效指標，VEGF、MMP-2 高表達的患者術后應積極行動脈化療栓塞術（Transhepatic arterial chemoembolization，TACE）治療[76]，以提高生存率。

4 結語

本研究通過網絡藥理學的方法，通過網絡關系探析藥物和疾病之間的作用關系，探究了黃連抗結直腸癌的物質基礎和作用機制，黃連的結構與我們研究的新化合物844 結構類似，對課題進步一研究具有重要參考價值及指導意義。

綜上所述，黃連中的黃酮醇類類和生物堿類等多成分，可通過多靶點、多通路協同發揮抗結直腸癌的作用與我們后期開展的實驗研究結果相一致。CA1、CA12、CA2、CA9、AKT1、EGFR、PTGS2 和SRC 等可能是其核心治療靶點，PI3K-AKT、Ras、Rap1 和VEGF 等可能是其主要作用通路。在臨床實際應用中，黃連雖然被用于癌癥治療中，但往往僅作為隨證加減輔助用藥來提高患者的免疫水平，其治療癌癥的能力還有待不斷挖掘探索。目前針對黃連治療結直腸癌相關的基礎研究較少，大多數研究的關注點在于黃連活性成分對癌疾病治療的作用，但對其發揮抑癌的具體作用機制尚不明確，并且至今未有系統的網絡藥理學對黃連抗結直腸癌的有效靶標和相關信號通路進行深入研究分析。為更好應用中草藥來治療癌癥，我們需要對黃連有效成分進行分析，對藥物作用靶點以及藥物是通過哪條信號通路在機體內發揮藥效進行更深入的探究。因此，本文具有一定現實意義與創新性，但是對現有的數據庫中進行分析挖掘，一定程度上也存在局限性，需要后期基礎研究和臨床研究進一步驗證，同時希望通過后續試驗驗證，表明結果的準確性。