安石榴苷對煙曲霉菌誘導小鼠巨噬細胞炎癥反應影響

[摘要] 目的 探討安石榴苷（PUN）對煙曲霉菌菌絲誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎性因子及活性氧（ROS）釋放的影響，評價PUN的抗炎作用。

方法 提取8周齡C57BL/6雌鼠腹腔巨噬細胞，經不同濃度PUN預處理2 h后加入滅活煙曲霉菌菌絲。采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測炎癥因子及模式識別受體mRNA的表達，蛋白印跡法（Western blotting）檢測白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白的表達，DCFA-DA熒光探針檢測不同時間點細胞內ROS水平。

結果 25、50、100 mg/L的PUN預處理2 h，可以顯著降低煙曲霉菌菌絲刺激誘導的巨噬細胞IL-1β、IL-6、白細胞介素10（IL-10）、TNF-α、巨噬細胞炎性蛋白2（MIP2）、趨化因子1（CXCL1）mRNA表達（F=339.4～2 420.0，P<0.01）和IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達（F=71.7～501.3，P<0.01）。小鼠腹腔巨噬細胞經不同濃度PUN預處理2 h再加入煙曲霉菌菌絲1、2、4、8、12、24 h時，細胞ROS含量均較對照組降低，差異具有統計學意義（F=439.5～739.8，P<0.01）。此外，PUN可以顯著抑制煙曲霉菌菌絲誘導的巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和Toll樣受體4（TLR4）mRNA表達（F=683.1、271.2，P<0.01）。

結論 PUN可能通過對模式識別受體TLR4的抑制，抑制真菌菌絲誘導的巨噬細胞炎性因子的生成，下調細胞內氧化應激水平。

[關鍵詞] 安石榴苷;巨噬細胞;煙曲霉菌;炎癥;氧化性應激;小鼠

[中圖分類號] R285.5;R364.5

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0402-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.029

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200824.0958.001.html;2020-08-25 09：28：46

EFFECT OF PUNICALAGIN ON THE INFLAMMATORY RESPONSE OF MURINE MACROPHAGES INDUCED BY ASPERGILLUS FUMIGATUS

LIN Hao， WANG Qian， ZHAO Guiqiu

（Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qing-

dao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the anti-inflammatory effect of punicalagin （PUN） by evaluating its regulation of inflammatory cytokines and reactive oxygen species （ROS） in Aspergillus fumigatus-induced macrophages collected from the abdominal cavity of mice.

Methods The macrophages were collected from the abdominal cavity of female C57BL/6 rats aged 8 weeks and the inactivated hyphae of Aspergillus fumigatus were added after pretreatment with different concentrations of PUN for 2 h. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of inflammatory cytokines and inflammatory cytokines; Western blotting was used to measure the protein expression of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）; DCFA-DA fluorescent probe was used to measure the level of ROS in cells at different time points.

Results The 2 h pretreatment with PUN （25， 50， and 100 mg/L） significantly reduced the mRNA expression of IL-1β， IL-6， IL-10， TNF-α， MIP2， and the chemokine CXCL1 （F=339.4-2420.0，Plt;0.01） and protein expression of IL-1β， IL-6， and TNF-α （F=71.7-501.3，Plt;0.01） in macrophages stimulated by the hyphae of Aspergillus fumigatus. Compared with the control group， the murine macrophages had a significantly lower ROS level at 1， 2， 4， 8， 12， and 24 h of treatment with the hyphae of Aspergillus fumigatus after the 2 h pretreatment with different concentrations of PUN （F=439.5-739.8，Plt;0.01）. In addition， PUN significantly inhibited the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase and Toll-like receptor 4 （TLR4） in the macrophages induced by the hyphae of Aspergillus fumigatus （F=683.1，271.2;Plt;0.01）.

Conclusion PUN can inhibit the production of inflammatory cytokines and downregulate the level of oxidative stress in macrophages induced by the hyphae of Aspergillus fumigatus， possibly by inhibiting the pattern recognition receptor TLR4.

[KEY WORDS]punicalagin; macrophages; Aspergillus fumigatus; inflammation; oxidative stress; mice

煙曲霉菌是自然界中常見的致病微生物[1]。當人體外部屏障被破壞或免疫功能低下時煙曲霉菌極易致病[2]。煙曲霉菌導致的炎癥在充分抗真菌藥物治療后仍難以控制，原因在于其致病機制除了真菌侵襲對正常組織造成破壞之外[3]，煙曲霉菌本身具備的抗原性也增加了組織的炎癥程度[4-5]。安石榴苷（PUN）是從石榴皮中提取的鞣花酸類物質，因其強大的抗炎作用被廣泛應用于中醫藥及化妝品中[6]。既往研究結果表明，PUN在抗炎、抗氧化、抗癌、抗真菌、抗細菌等方面均發揮重要作用[7-11]。巨噬細胞是PUN發揮抗炎作用的靶點[6]。已有研究證實，PUN能夠通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路減少活性氧（ROS）和一氧化氮的產生，增加超氧化物歧化酶1（SOD1） mRNA的表達，從而抑制脂多糖誘導的巨噬細胞的氧化應激[7]。另有研究表明，PUN能夠通過核因子κB（NF-κB）信號通路抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）基因表達，降低小膠質細胞的炎癥反應[12]。本研究旨在探討PUN對煙曲霉菌誘導炎癥的作用及其可能機制，以期為臨床治療煙曲霉菌感染所致的炎癥性疾病提供新思路。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級C57BL/6雌鼠（8周齡），由江蘇省動物實驗中心提供，經檢驗檢疫均合格，全身情況良好。實驗動物使用符合美國眼科和視覺研究協會（ARVO）關于動物使用的標準。

1.2 小鼠腹腔巨噬細胞的提取

小鼠腹腔注射體積分數0.03的硫代乙醇培養液1 mL，8 d后于無菌環境下收集腹腔積液細胞。向小鼠腹腔注射10 mL高糖DMEM（Hyclone，美國），充分按摩后吸出，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，用含體積分數0.10 FBS（Hyclone，美國）的DMEM重懸細胞，轉移至孔板。2 h后光鏡下觀察到細胞貼壁后更換培養液，進行預處理。

1.3 藥物細胞毒性測定

巨噬細胞在96孔板中貼壁后更換含有不同濃度PUN（Sigma，美國）的細胞培養液（體積分數0.10FBS+DMEM）100 μL，分別于24和48 h時加入CCK-8（MCE，美國）10 μL，37 ℃ 孵育2 h后，用分光光度計（Eppendorf，德國）測量每孔450 nm波長處光密度值。

1.4 滅活煙曲霉菌菌絲的制備

煙曲霉菌購自中國普通微生物培養物保藏中心。收集煙曲霉菌的孢子及菌絲，加入體積分數0.75的乙醇，混勻后置4 ℃冰箱過夜滅活菌絲。次日離心菌液，以無菌PBS（Solarbio，中國北京）洗滌3次，離心去上清液，加入DMEM混勻，細胞計數板計數后調整菌絲終濃度為1×108/CFU。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測各指標mRNA表達

用12孔板培養巨噬細胞，將細胞分為正常組（normal組，A組）、加菌對照組（A.F.組，B組）、加菌加不同濃度PUN組（A.F.+25 mg/L PUN組、A.F.+50 mg/L PUN組、A.F.+100 mg/L PUN組，C、D、E組）。滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后，每孔加入500 μL RNAisoPlus（大連寶生物工程有限公司），冰上裂解30 min后用細胞刮收集樣本至EP管，提取總RNA，按照Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser（大連寶生物工程有限公司）試劑逆轉錄步驟，建立2 μg逆轉錄反應體系。使用β-actin為內參照，應用RT-PCR儀（Eppendorf公司，德國）進行PCR擴增反應，分別檢測炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、白細胞介素10（IL-10）、TNF-α、巨噬細胞炎性蛋白2（MIP2）、趨化因子1（CXCL1）mRNA表達以及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和Toll樣受體4（TLR4）mRNA表達。引物序列于GenBank中查找，由TaKaRa寶生物工程有限公司負責引物的設計及合成。PCR引物序列見表1。實驗重復3次。

1.6 蛋白印跡法（Western blotting）檢測IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達

滅活煙曲霉菌菌絲刺激16 h后，于6孔板中每孔加入100 μL蛋白裂解液（RIPA∶PMSF= 100∶1），用細胞刮收集細胞蛋白于1.5 mL EP管中，置冰上裂解2 h，4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，中國北京）測定蛋白濃度并計算上樣量。蛋白煮沸變性，行凝膠電泳，轉膜，封閉液（Solarbio，中國北京）封閉2 h。加一抗IL-1β（1∶500，美國RD）、IL-6（1∶500，中國Bioss）、TNF-α（1∶400，美國Cell Signaling Technology）、β-actin（1∶1 000，中國武漢Elabscience）、β-tubulin（1∶1 000，中國武漢Elabscience），4 ℃孵育過夜。以PBST搖洗3次，每次10 min，加二抗（1∶1 000，中國武漢Elabscience）室溫孵育2 h。以PBST搖洗3次，每次10 min。用ECL（Byotime，中國北京）顯色，UVP凝膠成像系統（VILBER LOURM，美國）顯像，采用Image J軟件分析蛋白條帶。實驗重復5次。

1.7 DCFH-DA檢測細胞內ROS含量

巨噬細胞在96孔板中貼壁后更換培養液預處理2 h，加入滅活煙曲霉菌菌絲。在相應時間點加入DCFH-DA探針（1∶1 000，美國MCE）37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3次后使用熒光分光光度計，以488 nm激發波長、525 nm發射波長，實時檢測熒光強度。實驗重復3次。

1.8 統計學分析

應用Graph Pad 7.0 軟件進行統計分析，計量資料數據以±s形式表示，組間比較用One-way ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 PUN對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞毒性

巨噬細胞貼壁后分別加入含有0、25、50、100、200 mg/L PUN的細胞培養液培養，在培養24、48 h時，各濃度組光密度值比較差異均無統計學意義（P>0.05），提示25～200 mg/L PUN在48 h內對小鼠腹腔巨噬細胞無細胞毒性。見表2。

2.2 PUN對腹腔巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后，B組細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP2及CXCL1 mRNA的表達水平較A組顯著升高，PUN可濃度依賴性降低上述炎癥因子mRNA的表達水平，差異均有統計學意義（F=339.4～2 420.0，P<0.01）。見表3。

2.3 PUN對巨噬細胞炎癥因子蛋白表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激16 h后，B組細胞炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平較A組顯著升高，PUN可濃度依賴性降低上述炎癥因子蛋白表達水平，差異均有統計學意義（F=71.7～501.3，P<0.01）。見表4。

2.4 PUN對巨噬細胞氧化應激水平的影響

巨噬細胞于96孔板中貼壁后，使用PUN預處理，加入滅活煙曲霉菌菌絲刺激，分別于加菌后1、2、4、8、16、24 h應用DCFH-DA探針檢測細胞內ROS水平。與加菌刺激前相比較，加菌后細胞內ROS水平升高，于8 h時達峰，隨后降低。不同濃度PUN組間比較，各時間點的細胞ROS水平差異均有統計學意義（F=439.5～739.8，P<0.01）。見圖1。滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后，RT-PCR檢測結果顯示，隨PUN濃度升高，iNOS mRNA表達水平呈濃度依賴性降低，各組間差異均具有統計學意義（F=683.1，P<0.01）。見表5。

2.5 PUN對TLR4表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后，B組細胞TLR4 mRNA表達水平較A組顯著升高，PUN可濃度依賴性降低TLR4 mRNA的表達水平，差異均有統計學意義（F=3 271.2，P<0.01）。見表5。

3 討" 論

PUN提取自石榴皮，是一種水溶性鞣花酸類物質，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等多種作用。特別是其抗炎藥理作用，已在人體外腸道模型、豬離體皮膚等多種組織中被證實[13-15]。已有研究表明，巨噬細胞是PUN在炎癥中作用的靶點，其在真菌性炎癥疾病的病程中發揮重要作用[16]。巨噬細胞能夠識別和內化來自組織微環境的凋亡細胞和外來病原體，并且啟動炎癥和其他免疫細胞的活化[17]，巨噬細胞產生的炎癥因子介導的直接損傷和免疫細胞的趨化募集是組織發生過度炎癥反應的重要原因。有研究顯示，PUN可以下調脂多糖刺激后RAW264.7細胞系炎癥因子的表達[18-20]，但PUN對真菌刺激后巨噬細胞炎癥反應的影響尚未見研究報道。本實驗對此進行了探討。

本文RT-PCR及Western blotting檢測結果顯示，經PUN預處理及真菌刺激后，隨PUN濃度升高，巨噬細胞IL-1β等炎癥因子以及模式識別受體TLR4的表達水平呈濃度依賴性降低。且ROS檢測結果表明，高濃度的PUN可以抑制滅活煙曲霉菌菌絲刺激后小鼠腹腔巨噬細胞的ROS水平。

大量研究結果表明，NF-κB是真菌性角膜炎炎癥反應中重要的調節因子，它可以調節IL-1β等炎癥因子，通過這些細胞因子趨化炎癥細胞向病變部位浸潤[21]。KIM等[22]的研究表明，PUN可直接與神經組織炎癥中的NF-κB亞基p50結合，下調其活性，進而影響NF-κB下游炎癥因子的產生。炎癥因子能夠直接導致組織損傷，擴大下游炎癥反應，并募集其他炎癥細胞，加重真菌性角膜炎的嚴重程度。XU等[7]的研究證實，PUN可以上調Nrf2介導的通路并增強血加氧酶-1表達，導致ROS產生減少和一氧化氮產生過量。此外，PUN也能夠降低人表皮角質形成細胞、泡沫細胞、NIH3T3細胞等的氧化應激水平[23-25]。本實驗結果與以往研究結果一致，提示PUN可對巨噬細胞中炎癥因子和ROS的表達產生影響。

綜上所述，PUN能夠減輕煙曲霉菌誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的炎癥反應，降低巨噬細胞氧化應激水平，并且PUN預處理能夠降低細胞模式識別受體的表達，提示PUN可能通過下調TLR4表達對巨噬細胞產生抗炎作用。但PUN抗炎作用的具體機制還有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]DE LUCA A， IANNITTI R G， BOZZA S， et al. CD4（+） T cell vaccination overcomes defective cross-presentation of fungal antigens in a mouse model of chronic granulomatous di-

sease[J]. J Clin Investig， 2012，122（5）：1816-1831.

[2]LATGE J P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis[J]. Clin Microbiol Rev， 1999，12（2）：310-350.

[3]ORCIUOLO E， STANZANI M， CANESTRARO M， et al. Effects of Aspergillus fumigatus gliotoxin and methylprednisolone on human neutrophils： implications for the pathoge-

nesis of invasive aspergillosis[J]. Journal of Leukocyte Biology， 2007，82（4）：839-848.

[4]BOCHUD P Y， CHIEN J W， MARR K A， et al. Toll-like receptor 4 polymorphisms and aspergillosis in stem-cell transplantation[J]. N Engl J Med， 2008，359（17）：1766-1777.

[5]THOMAS P A. Current perspectives on ophthalmic mycoses[J]. Clin Microbiol Rev， 2003，16（4）：730-797.

[6]XU X L， GUO Y H， ZHAO J X， et al. Punicalagin， a PTP1B inhibitor， induces M2c phenotype polarization via up-regulation of HO-1 in murine macrophages[J]. Free Radic Biol Med， 2017，110：408-420.

[7]XU Q， ZHAO G Q， LIN J， et al. Role of Dectin-1 in the innate immune response of rat corneal epithelial cells to Aspergillus fumigatus[J]. BMC Ophthalmol， 2015，15：126.

[8]CAO K， XU J， PU W J， et al. Punicalagin， an active compo-nent in pomegranate， ameliorates cardiac mitochondrial impairment in obese rats via AMPK activation[J]. Sci Rep， 2015，5：14014.

[9]ZOU X， YAN C H， SHI Y J， et al. Mitochondrial dysfunction in obesity-associated nonalcoholic fatty liver disease：the protective effects of pomegranate with its active component punicalagin[J]. Antioxid Redox Signal， 2014，21（11）：1557-1570.

[10]KUMAGAI Y， NAKATANI S， ONODERA H， et al. Anti-glycation effects of pomegranate （Punica granatum L.） fruit extract and its components in vivo and in vitro[J]. J Agric Food Chem， 2015，63（35）：7760-7764.

[11]WANG Y， CHEN B S， LONGTINE M S， et al. Punicalagin promotes autophagy to protect primary human syncytiotrophoblasts from apoptosis[J]. Reprod Camb Engl， 2016，151（2）：97-104.

[12]OLAJIDE O A， KUMAR A， VELAGAPUDI R， et al. Punicalagin inhibits neuroinflammation in LPS-activated rat primary microglia[J]. Mol Nutr Food Res， 2014，58（9）：1843-1851.

[13]HOLLEBEECK S， WINAND J， HRENT M F， et al. Anti-inflammatory effects of pomegranate （Punica granatum L.） husk ellagitannins in Caco-2 cells， an in vitro model of human intestine[J]. Food amp; Function， 2012，3（8）：875-885.

[14]HOUSTON D M， BUGERT J， DENYER S P， et al. Anti-inflammatory activity of Punica granatum L. （Pomegranate） rind extracts applied topically to ex vivo skin[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics， 2017，112：30-37.

[15]LYU A， CHEN J J， WANG H C， et al. Punicalagin protects bovine endometrial epithelial cells against lipopolysaccharide-induced inflammatory injury[J]. J Zhejiang Univ Sci B， 2017，18（6）：481-491.

[16]SUN Q Q， LI C， LIN J， et al. Celastrol ameliorates Aspergillus fumigatus keratitis via inhibiting LOX-1[J]. International Immunopharmacology， 2019，70：101-109.

[17]PEISER L， GORDON S. The function of scavenger receptors expressed by macrophages and their role in the regulation of inflammation[J]. Microbes Infect， 2001，3（2）：149-159.

[18]BENSAAD L A， KIM K H， QUAH C C， et al. Anti-inflammatory potential of ellagic acid， gallic acid and punicalagin Aamp;B isolated from Punica granatum[J]. BMC Complementary Altern Med， 2017，17（1）：47.

[19]XU X L， LI H Q， HOU X L， et al. Punicalagin induces Nrf2/HO-1 expression via upregulation of PI3K/AKT pathway and inhibits LPS-induced oxidative stress in RAW264.7 macrophages[J]. Mediators of Inflammation， 2015，2015：380218.

[20]XU X L， YIN P， WAN C R， et al. Punicalagin inhibits inflammation in LPS-induced RAW264.7 macrophages via the suppression of TLR4-mediated MAPKs and NF-κB activation[J]. Inflammation， 2014，37（3）：956-965.

[21]徐玲娟，謝立信. 真菌性角膜炎的分子機制研究進展[J]. 中華眼視光學與視覺科學雜志， 2010，12（3）：237-240.

[22]KIM Y E， HWANG C J， LEE H P， et al. Inhibitory effect of punicalagin on lipopolysaccharide-induced neuroinflammation，oxidative stress and memory impairment via inhibition of nuclear factor-kappaB[J]. Neuropharmacology， 2017，117：21-32.

[23]CHEN P S， LI J H. Chemopreventive effect of punicalagin， a novel tannin component isolated from Terminalia catappa， on H-ras-transformed NIH3T3 cells[J]. Toxicol Lett， 2006，163（1）：44-53.

[24]ROSENBLAT M， VOLKOVA N， AVIRAM M. Pomegranate phytosterol （β-sitosterol） and polyphenolic antioxidant （punicalagin） addition to statin， significantly protected against macrophage foam cells formation[J]. Atherosclerosis， 2013，226（1）：110-117.

[25]SEOK J K， LEE J， KIM Y， et al. Punicalagin and （-）-epigallocatechin-3-gallate rescue cell viability and attenuate inflammatory responses of human epidermal keratinocytes exposed to airborne particulate matter PM10[J]. Skin Pharmacology and Physiology， 2018，31（3）：134-143.

（本文編輯 馬偉平）