纖維素對結直腸癌小鼠腸道屏障功能及炎癥指標影響

[摘要] 目的 探討纖維素對氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）模型小鼠結直腸癌發生發展的抑制作用及其可能的機制。

方法 采用AOM/DSS建立結腸炎癥腫瘤模型后，給予不同纖維素含量的AIN-93M飼料，進行干預性實驗。實驗結束后處死小鼠，計算各組小鼠抑瘤率。采用實時定量PCR（RT-PCR）法檢測小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、閉鎖帶-1（ZO-1）mRNA表達，Western blot法檢測結直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-12（IL-12）、環氧化酶-2（COX-2）的表達。

結果 纖維素低、中、高劑量組的抑瘤率分別為47.06%、61.34%、73.95%。與模型組相比，纖維素低、中、高劑量組小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1的mRNA和蛋白表達水平降低（F=13.34、162.21，P<0.05），而Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表達水平升高（F=40.55～152.56，P<0.05）。與模型組相比，纖維素低、中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達水平明顯降低（F=43.15、231.09，P<0.05），IL-12的表達水平明顯升高（F=243.45，P<0.05）。

結論 纖維素能夠顯著抑制炎癥性結直腸癌腫瘤的發生，其可能的機制是通過改善腸道屏障功能和改善腸道炎癥達到抑癌作用。

[關鍵詞] 纖維素;結直腸腫瘤;炎癥;小鼠

[中圖分類號] R735.34;R343.93

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0445-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.025

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200821.1555.002.html;2020-08-24 11：45：42

EFFECT OF CELLULOSE ON INTESTINAL BARRIER FUNCTION AND INFLAMMATORY MARKERS IN MICE WITH COLO-

RECTAL CANCER

LI Qianqian， CHEN Chen， LIU Xiaohan， CI Yifan，" SONG Yang

（School of Public Health， Qingdao University， Qingdao 266073， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the inhibitory effect of cellulose on the development and progression of colorectal cancer in a mouse model of colorectal cancer induced by azoxymethane （AOM）/dextran sodium sulfate （DSS） and its possible mechanism.

Methods After the model of colorectal cancer was established by AOM/DSS， the mice were fed with AIN-93M diet containing different contents of cellulose to perform an intervention experiment. The mice were sacrificed at the end of the experiment， and tumor inhibition rate was calculated for each group. RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Claudin-1， Occludin， and zonula occluden-1 （ZO-1） in colorectal tumor tissue， and ELISA was used to mea-

sure the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-12 （IL-12）， and cyclooxygenase-2 （COX-2） in serum.

Results The tumor inhibition rates in the low-， middle-， and high-dose cellulose groups were 47.06%，61.34%， and 73.95%， respectively. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the mRNA and protein expression of Claudin-1 （F=13.34，162.21;Plt;0.05） and significant increases in the mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 （F=40.55-152.56，Plt;0.05） in colorectal tumor tissue. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the serum levels of TNF-α and COX-2 （F=43.15，231.09;Plt;0.05） and a significant increase in the serum level of IL-12 （F=243.45，Plt;0.05）.

Conclusion Cellulose can significantly inhibit the development of inflammatory colorectal cancer， possibly by improving intestinal barrier function and intestinal inflammation.

[KEY WORDS]cellulose; colorectal neoplasms; inflammation; mice

結直腸癌（CRC）是世界上第三大常見的癌癥，也是導致癌癥死亡的常見原因之一[1]。只有10%的CRC病例具有遺傳易感性，高達90%的病例無家族史或遺傳易感性[2]。與CRC發展有關的環境因素包括吸煙、酗酒、肥胖、久坐的生活方式、2型糖尿病、紅肉的攝入、高脂肪飲食和纖維攝入量不足等。慢性炎癥也是CRC發生的重要環境危險因素之一[3]。有研究表明，一些促炎因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以通過影響緊密連接（TJ）蛋白的表達，誘導腸道黏膜屏障功能受損[4-5]。而腸道黏膜屏障功能受損，如腸上皮細胞完整性破壞、腸黏膜通透性增加等與炎癥相關[6]。腸道屏障功能受損和促炎因子共同作用，促進了CRC的發生發展[7]。纖維素是一種不可溶性膳食纖維，主要存在于蔬菜和水果等植物組織中[8]。有研究發現，補充纖維素可以減輕葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠炎癥，抑制其腫瘤的發生[9-10]。MOEN等[11]的研究結果也表明，纖維素能夠降低氧化偶氮甲烷（AOM）誘導的A/J Min+小鼠的腫瘤負荷。纖維素具有抗炎和抗腫瘤作用，其可能的機制是改善了腸道屏障功能，但目前相關研究尚少。因此，本研究通過建立小鼠結直腸炎癥腫瘤模型，探討不同纖維素濃度膳食對結直腸腫瘤發生、炎癥及腸道屏障功能的影響?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級C57BL/6小鼠100只，雄性，6～8周齡，體質量20～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（質量合格證號：37009200015329），飼養于清潔級動物飼養室。AOM購自美國SIGMA公司。DSS購自大連美侖生物技術有限公司。纖維素購自北京華邁科生物技術有限責任公司。小鼠飼料購自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，在標準AIN-93M飼料的基礎上，脫去或調整纖維素含量制成含0、25、50及100 g/L纖維素的AIN-93M飼料。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會審批通過（倫審批件號：QYFYWZLL25668）。

1.2 研究方法

1.2.1 動物模型制備 采用AOM/DSS建立結腸炎癥腫瘤模型。第1天，小鼠腹腔注射濃度為1 g/L的AOM 10 mg/kg，7 d后，飲水給予20 g/L的DSS，自由飲水7 d，間隔14 d，循環3個周期，完成模型制備。

1.2.2 動物分組及其干預措施 將100只雄性C57BL/6小鼠按體質量隨機分為對照組（CG組，標準AIN-93M飼料喂養）、模型組（MG組，不含纖維素的飼料喂養）、纖維素低劑量組（LCEG組，含25 g/L纖維素飼料喂養），纖維素中劑量組（MCEG組，含50 g/L纖維素飼料喂養）和纖維素高劑量組（HCEG組，含100 g/L纖維素飼料喂養），每組20只。用標準AIN-93M飼料適應性喂養1周后，各組小鼠給予不同纖維素含量的AIN-93M飼料，預防性飲食干預2周后，模型組及纖維素低、中、高劑量組小鼠建立AOM/DSS模型。實驗期間，各組小鼠給予相應的AIN-93M鼠糧干預，直至實驗結束，實驗持續13周。

1.2.3 小鼠一般狀態及腫瘤發生情況觀察 每周記錄小鼠體質量，每2 d記錄小鼠進食進水量，觀察各組小鼠精神、活動、毛色、飲食和排泄物等情況。于末次干預后24 h，眼球摘除取血;頸椎脫臼處死小鼠，剝離結直腸組織，剖開小鼠結直腸，記錄腫瘤發生數（腫瘤最大直徑≥2 mm），按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率=（模型組腫瘤平均數量-纖維素干預組腫瘤平均數量）/模型組腫瘤平均數量×100%。

1.2.4 小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和閉鎖帶-1（ZO-1）mRNA表達檢測 采用實時定量PCR（RT-PCR）方法分別檢測小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達水平。用TRIzol試劑提取組織總RNA，用IMPLEN納米光度計、P-330核酸檢測儀測定mRNA濃度和純度。本研究中A260/A280比值范圍為1.90～2.00，說明樣品質量良好。使用Primer Script RT Reagent Kit和Bio-Rad MyCycler PCR儀反向轉錄RNA（2 μg）。

PCR引物序列見表1。PCR通過Eppendorf Mastercycler EP梯度系統（Eppendorf）根據制造商說明進行操作。反應體積20 μL，進行兩步循環，包括95 ℃的變性步驟和60 ℃的退火/延伸聯合步驟。GADPH作為內參基因。使用比較式2-△△ct計算基因表達的相對水平。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.5 小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達水平。取50～100 mg腫瘤組織，用無菌手術剪將組織剪成細小的碎片，然后加入含磷酸酶抑

制劑的RIPA裂解液，提取腫瘤組織的總蛋白。用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液，混勻，加熱使蛋白變性。蛋白冷卻后加入SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，將分離后的蛋白分子轉移至PVDF膜上。再用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后加入二抗孵育2 h。加入ECL發光液在Fusion FX5顯影儀中顯影，得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.6 小鼠血清中TNF-α、白細胞介素-12（IL-12）和環氧化酶-2（COX-2）的檢測 按照酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒說明書操作，在酶標儀上讀取450 nm波長處各孔吸光度值，按稀釋標準品制作的標準曲線計算出樣本中細胞因子含量。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理及統計學分析，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 各組小鼠一般狀態及腫瘤發生情況

除CG組外，在飲水中加入20 g/L的DSS期間及之后1周內，其他各組小鼠均出現毛色無光澤，呈靜電樣改變，活動減少，糞便性狀改變，以及稀便、脫肛、血便等癥狀。但隨著正常飲水，以上現象均會改善。CG、MG、LCEG、MCEG和HCEG組小鼠的存活率分別為100%（20/20）、55%（11/20）、75%（15/20）、85%（17/20）和90%（18/20）。實驗結束之后解剖小鼠，觀察并記錄腫瘤的發生情況。LCEG、MCEG、HCEG組小鼠結直腸腫瘤數量較MG組減少，MCEG、HCEG組較LCEG組減少，HCEG組較MCEG組減少，差異均有顯著意義（F=93.23，P<0.05）。LCEG、MCEG和HCEG組的抑瘤率分別為47.06%、61.34%和73.95%。見表2。

2.2 各組小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達比較

研究結果表明，MG組小鼠結直腸腫瘤組織中的Claudin-1 mRNA表達水平較CG組明顯升高，而LCEG、MCEG、HCEG組Claudin-1 mRNA表達水平較MG組明顯降低，差異有統計學意義（F=13.34，P<0.05）。MG組小鼠結直腸腫瘤組織中的Occludin、ZO-1 mRNA表達水平較CG組明顯降低，而MCEG、HCEG組Occludin、ZO-1 mRNA表達水平較MG組明顯升高，差異均有顯著性（F=152.56、65.30，P<0.05）;MG組和LCEG組小鼠結直腸腫瘤組織中ZO-1、Occludin mRNA表達水平差異無顯著性（P>0.05）。見表3。

2.3 各組小鼠結直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達的比較

MG組小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1蛋白表達水平較CG組明顯升高，LCEG、MCEG、HCEG組Claudin-1蛋白表達水平較MG組明顯降低，差異均有顯著性（F=162.21，P<0.05）。MG組小鼠結直腸腫瘤組織中Occludin、ZO-1蛋白表達水平較CG組明顯降低，LCEG、MCEG、HCEG組Occludin 蛋白表達水平較MG組明顯升高，MCEG、HCEG組ZO-1蛋白表達水平較MG組明顯升高，差異均有顯著性（F=115.12、40.55，P<0.05）;而MG組和LCEG組小鼠結直腸腫瘤組織中ZO-1 蛋白表達水平差異無顯著性（P>0.05）。見圖1、表4。

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子表達的比較

與CG組相比，MG、LCEG、MCEG和HCEG組小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達水平明顯升高，IL-12的表達水平明顯降低;與MG組相比較，LCEG、MCEG和HCEG組小鼠血清中TNF-α的表達水平明顯降低，IL-12的表達水平明顯升高，MCEG和HCEG組小鼠血清中COX-2的表達水平明顯降低（F=43.15～243.45，P<0.05）。MG組和LCEG組小鼠血清中COX-2的表達水平差異無顯著性（P>0.05）。見表5。

3 討" 論

研究表明，纖維素可以減輕腸道炎癥和抑制腫瘤發生[8-9]。本研究通過AOM/DSS誘導成功建立小鼠結直腸炎癥腫瘤模型，用含不同濃度纖維素的飼料進行干預，結果顯示，與MG組相比，纖維素干預能夠使AOM/DSS誘導的CRC小鼠的腫瘤數量降低，增加結直腸腫瘤的抑瘤率。另外，本研究還顯示，纖維素干預能夠影響小鼠結直腸腸道屏障功能。

TJ由跨膜蛋白（如Occludins、Claudins）和連接黏附分子以及外周膜蛋白（如zona occludens，ZO-1、-2、-3）等組成[10]。在健康狀態下，TJ蛋白能夠構建一種動態的腸道屏障，調節細胞間隙對水、營養物質和電解質的攝取。而TJ功能障礙可以破壞腸道屏障的完整性，促進腸道炎癥以及結直腸腫瘤的發生[11]。Claudin-1能啟動TJ結構的形成活性，其過度表達可導致腸上皮細胞分化，使腸黏膜受損[12]。Occludin在胞外環和跨膜區選擇性調節細胞間隙的通透性[13]。ZO-1能夠與Occludin相結合，調節細胞間隙通透性，在細胞間具有黏附作用[14]。下調ZO-1的表達，能夠阻斷和破壞TJ復合體的完整性，增加上皮通透性[15]。

慢性炎癥和癌癥之間的聯系密切[2]。炎癥性腸病（IBD）包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD），該病病人患CRC的風險顯著增加[16]。有研究顯示，與健康對照組相比，UC病人結腸組織中Claudin-1蛋白表達上調[17]。PORITZ等[18]的研究結果也顯示，UC病人結腸樣本中Claudin-1蛋白的表達增加，Occludin蛋白的表達減少。KUCHARZIK等[19]的研究則顯示，UC和CD病人結直腸組織中的Occludin蛋白表達下調。SOLER等[20]研究表明，在人類和大鼠中，腸腫瘤周圍區域的TJ通透性增加;在人類腸道的腫瘤豐富區域TJ蛋白ZO-1和Occludin表達減少。纖維素能夠改善腸道黏膜屏障功能，抑制腸道炎癥及腫瘤的發生發展[8-9]。與上述研究結果一致，本研究結果也顯示，AOM/DSS誘導的結直腸炎癥腫瘤模型小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達水平明顯升高，Occludin、ZO-1的表達水平明顯降低;纖維素干預后，Claudin-1的表達水平明顯降低，Occludin、ZO-1的表達水平明顯升高。表明AOM/DSS誘導的結直腸炎癥腫瘤模型小鼠，其TJ功能受損，結直腸腸道屏障的完整性被破壞，而纖維素的干預使TJ功能得到一定程度的恢復，從而保護腸道屏障的完整性。

腸黏膜屏障功能受損可能與腸道炎癥有關，因此本研究還檢測了小鼠血清中的炎癥相關指標。TNF-α可以通過增加肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化影響TJ，降低上皮屏障功能[21]。本文研究結果顯示，AOM/DSS誘導的結直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中TNF-α的表達水平明顯升高，在纖維素干預后，小鼠血清中TNF-α的表達水平明顯降低，腸道炎癥改善。表明纖維素干預可能通過調控炎癥因子TNF-α表達，改善腸道屏障功能。IL-12在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中起重要作用，與正常人相比，CRC病人外周血中IL-12的表達水平明顯降低[22]。本研究中，IL-12在結直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中的表達水平明顯降低，在纖維素干預各組中的表達水平明顯升高。COX-2在炎癥過程中是重要的限速酶，其高表達與慢性炎癥和腫瘤的發生有關[23]。本研究結果顯示，在結直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中COX-2的表達水平明顯升高，在纖維素干預組中其表達水平明顯降低。可見，纖維素干預可使結直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道炎癥減輕。

綜上所述，纖維素干預能夠減少AOM/DSS誘導的模型小鼠的腫瘤數;降低小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達，升高Occludin、ZO-1的表達，改善腸道屏障功能;降低小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達水平，升高IL-12的表達水平，減輕腸道炎癥。纖維素干預可能通過改善AOM/DSS誘導的結直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道屏障功能，減輕其腸道炎癥，而抑制結直腸腫瘤的發生。但相關機制還需進一步研究。

[參考文獻]

[1]FREDDIE B， JACQUES F， ISABELLE S， et al. Global can-

cer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]." CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]LONG A G， LUNDSMITH E T， Hamilton K E. Inflammation and colorectal cancer[J]." Curr Colorectal Cancer Rep， 2017，13（4）：341-351.

[3]FAZIO V， ROBERTIS M， MASSI E， et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis： from pathways to diagnosis and therapy studies[J]." Journal of Carcinogenesis， 2011，10（1）：9.

[4]VANCAMELBEKE M， VERMEIRE S. The intestinal bar-

rier： a fundamental role in health and disease[J]." Expert Rev Gastroenterol Hepatol， 2017，11（9）：821-834.

[5]BARMEYER C， SCHULZKE J D， FROMM M. Claudin-related intestinal diseases[J]." Semin Cell Dev Biol， 2015，42（1）：30-38.

[6]SNCHEZ DE MEDINA F， ROMERO-CALVO I， MASCARAQUE C， et al. Intestinal inflammation and mucosal barrier function[J]." Inflamm Bowel Dis， 2014，20（12）：2394-2404.

[7]DIAKOS C I， CHARLES K A， MCMILLAN D C， et al. Cancer-related inflammation and treatment effectiveness[J]." Lancet Oncol， 2014，15（11）：e493-e503.

[8]CUMMINGS J H. Cellulose and the human gut[J]." Gut， 1984，25（8）：805-810.

[9]WU W T， YANG L C， CHEN H L. Effects of konjac glucomannan， inulin and cellulose on acute colonic responses to genotoxic azoxymethane[J]." Food Chemistry， 2014，155：304-310.

[10]SCHOULTZ I， KEITA V. Cellular and molecular therapeutic targets in inflammatory bowel disease-focusing on intestinal barrier function[J]." Cells， 2019，8（2）：193.

[11]LANDY J， RONDE E， ENGLISH N， et al. Tight junctions in inflammatory bowel diseases and inflammatory bowel disease associated colorectal cancer[J]." World J Gastroenterol， 2016，22（11）：3117-3126.

[12]OUBAN A. Claudin-1 role in colon cancer： an update and a review[J]." Histol Histopathol， 2018，33（10）：1013-1019.

[13]FURUSE M， HIRASE T， ITOH M， et al. Occludin： a novel integral membrane protein localizing at tight junctions[J]." J Cell Biol， 1993，123（6 Pt 2）：1777-1788.

[14]FURUSE M， ITOH M， HIRASE T， et al. Direct association of occludin with ZO-1 and its possible involvement in the loca-

lization of occludin at tight junctions[J]." J Cell Biol， 1994，127（6 Pt 1）：1617-1626.

[15]DRAGO S， EL ASMAR R， DI PIERRO M， et al. Gliadin， zonulin and gut permeability： effects on celiac and non-celiac intestinal mucosa and intestinal cell lines[J]." Scandinavian Journal of Gastroenterology， 2006，41（4）：408-419.

[16]YANG D H. Recent advances in understanding colorectal can-

cer and dysplasia related to ulcerative colitis[J]." Korean J Gastroenterol： Taehan Sohwagi Hakhoe Chi， 2015，66（6）：312-319.

[17]POPE J L， BHAT A A， SHARMA A， et al. Claudin-1 regulates intestinal epithelial homeostasis through the modulation of Notch-signalling[J]." Gut， 2014，63（4）：622-634.

[18]PORITZ L S， HARRIS L R， KELLY A A， et al. Increase in the tight junction protein claudin-1 in intestinal inflammation[J]." Dig Dis Sci， 2011，56（10）：2802-2809.

[19]KUCHARZIK T， WALSH S V， CHEN J， et al. Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins[J]." The American Journal of Pathology， 2001，159（6）：2001-2009.

[20]SOLER A P， MILLER R D， LAUGHLIN K V， et al. Increased tight junctional permeability is associated with the development of colon cancer[J]." Carcinogenesis， 1999，20（8）：1425-1431.

[21]AL-SADI R， GUO S H， YE D M， et al. TNF-α modulation of intestinal tight junction permeability is mediated by NIK/IKK-α axis activation of the canonical NF-κB pathway[J]." The American Journal of Pathology， 2016，186（5）：1151-1165.

[22]LU X J. Impact of IL-12 in cancer[J]." Current Cancer Drug Targets， 2017，17（8）：682-697.

[23]ALBASRI A， ELKABLAWY M， HUSSAINY A， et al. Impact of COX-2 over-expression on the prognosis of colorectal cancer patients. An expression from Western Saudi Arabia[J]." Saudi Med J， 2018，39（8）：773-780.

（本文編輯 馬偉平）