A53T轉基因小鼠黑質Kv4.3 A型鉀通道的表達改變

[摘要]目的 探討不同月齡α-突觸核蛋白A53T轉基因小鼠黑質區Kv4.3 A型鉀通道的表達變化。方法選取不同月齡A53T轉基因小鼠和同窩野生型（WT）對照小鼠，采用蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測小鼠黑質區Kv4.3以及酪氨酸羥化酶（TH）蛋白的表達。結果 3月齡的A53T轉基因小鼠Kv4.3及TH蛋白的表達與WT小鼠比較差異無顯著性（P>0.05），15月齡的A53T轉基因小鼠Kv4.3蛋白表達較WT小鼠升高（t=3.202，P<0.01），TH蛋白表達較WT小鼠降低（t=2.475，P<0.05）。結論 黑質區Kv4.3 A型鉀通道隨著帕金森病（PD）病情的進展發生改變，可能參與了PD的發病過程。

[關鍵詞]鉀通道，電壓門控;黑質;α突觸核蛋白;小鼠，轉基因

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0163-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the change in the expression of Kv4.3 A-type potassium channels in transgenic mice with different ages in months expressing A53T human α-synuclein."Methods A53T transgenic mice with different ages in months and wild-type （WT） littermates were selected， and Western blot was used to measure the protein expression of Kv4.3 and tyrosine hydroxylase （TH） in the substantia nigra of mice."Results There were no significant differences in the protein expression of Kv4.3 and TH between the A53T transgenic mice aged 3 months and WT mice （Pgt;0.05）. Compared with WT mice， the A53T transgenic mice aged 15 months had significantly higher protein expression of Kv4.3 （t=3.202，Plt;0.01） and significantly lower protein expression of TH （t=2.475，Plt;0.05）."Conclusion Kv4.3 A-type potassium channels in the substantia nigra change with the progression of Parkinson’s disease （PD） and may be involved in the pathogenesis of PD.

[KEY WORDS]potassium channels， voltage-gated; substantia nigra; alpha-synuclein; mice， transgenic

帕金森病（PD）是全球第二大神經退行性疾病，其病理特征為中腦黑質（SN）區多巴胺（DA）能神經元選擇性死亡，殘存的DA能神經元出現以α-突觸核蛋白（α-syn）為主要成分的路易小體[1-3]。PD主要的臨床癥狀有靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢反射障礙等[4-6]。但到目前為止，PD病因及發病機制尚不明確，可能與遺傳、環境、鐵沉積、氧化應激、線粒體功能障礙等原因有關[7-11]。

鉀通道是目前發現的亞型最多、功能最復雜、分布最廣的一類離子通道，幾乎存在于所有生物體中[12]。

近年來有文獻報道，鉀通道的異常表達可能對PD有一定的調控作用[13]。A型鉀通道是電壓依賴型鉀通道的一個重要分支，在調控DA能神經元的動作電位、放電模式和放電頻率上具有重要的作用[14]。A型鉀通道共有5種亞型，有研究表明，Kv4.3 A型鉀通道在SN區DA能神經元上廣泛表達[15]。有研究對PD病人殘存的DA能神經元進行PCR分析，發現Kv4.3 mRNA表達明顯升高[16]，而阻斷A型鉀通道可以改善PD病人[17]以及PD大鼠模型[18]的運動功能障礙。然而，在PD疾病進展過程中A型鉀通道的表達變化目前尚不清楚。本實驗在攜帶人A53T突變型α-syn的轉基因小鼠（α-Syn A53T+/+小鼠）上，應用蛋白免疫印跡方法檢測了不同月齡的α-Syn A53T+/+小鼠以及同窩野生型（WT）小鼠SN區Kv4.3和酪氨酸羥化酶（TH）蛋白的表達水平，探究在PD的進展過程中A型鉀通道的變化，為PD提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 所用A53T轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室。α-Syn A53T+/-小鼠與α-Syn A53T+/-小鼠雜交得到下一代小鼠，通過基因組鑒定得到α-Syn A53T+/+小鼠、α-Syn A53T+/-小鼠及相對應的同窩WT小鼠。本實驗選用3月齡和15月齡α-Syn A53T+/+小鼠和同窩WT小鼠作為研究對象，每組6只。小鼠飼養條件：室溫（21±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜循環光照，可自由飲水、取食。

1.1.2 實驗儀器及試劑 Kv4.3抗體購自中國Absin公司，TH抗體購自美國Millipore公司，β-actin抗體購自中國博奧森公司。山羊抗兔二抗購自中國Absin公司。分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液均購于康為公司，ECL發光液、PVDF膜購自美國Millipore公司，APS、TEMED、RIPA裂解液、BCA試劑盒、Loading buffer購自中國碧云天公司。電泳儀、電轉儀購自美國BioRad公司，凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測SN區TH和Kv4.3蛋白的表達

小鼠用100 g/L水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，完整地取出包括中腦SN區的腦組織，置于冰盒內，取出雙側SN區域，分別放入預冷的1.5 mL EP管中，準確稱質量。加入蛋白裂解液充分研磨后，于冰上靜置30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，將上清轉移至新的EP管中，應用BCA法，測定波長562 nm處的吸光度值，根據標準品的吸光度繪制標準曲線，計算待測樣品的蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，按照樣品上樣量準確上樣，蛋白經SDS-PAGE電泳后，濕轉到PVDF膜上，轉膜完成后，將目的條帶完整切下，用50 g/L的脫脂奶粉于室溫搖床上封閉2 h;分別加入一抗Kv4.3（1∶1 000）、TH（1∶3 000）以及β-actin（1∶10 000），于4 ℃搖床上低速搖動孵育過夜。用TBST洗3次，每次10 min，加山羊抗兔（1∶10 000）的二抗在室溫下孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min。于ECL顯色試劑盒中取適量發光液均勻滴在PVDF膜上，室溫孵育1 min，用UVP凝膠成像系統拍攝圖片。在Image J圖像采集與分析軟件上對條帶進行灰度值分析。用Kv4.3、TH蛋白與β-actin的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析

應用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析。計量資料結果以x2±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同月齡α-Syn A53T+/+小鼠SN區Kv4.3蛋白表達比較

α-Syn A53T+/+組和WT組3月齡小鼠Kv4.3蛋白表達水平分別為0.965±0.040和0.844±0.084（n=6），差異無統計學意義（t=1.402，P>0.05）。α-Syn A53T+/+組和WT組15月齡小鼠Kv4.3蛋白表達水平分別為1.855±0.101和1.343±0.124（n=5），α-Syn A53T+/+組Kv4.3蛋白表達明顯上調，差異具有統計學意義（t=3.202，P<0.05）。

2.2 不同月齡α-Syn A53T+/+小鼠SN區TH蛋白表達變化

α-Syn A53T+/+組和WT組3月齡小鼠TH蛋白表達水平分別為1.030±0.099和0.928±0.135（n=5），差異無統計學意義（t=0.612，P>0.05）。α-Syn A53T+/+組和WT組15月齡小鼠TH蛋白表達水平分別為1.586±0.1205和1.975±0.1008（n=6），α-Syn A53T+/+組TH表達明顯下調，差異具有統計學意義（t=2.475，P<0.05）。

3 討 論

近年來的研究顯示，PD的發病可能與鉀離子通道功能異常有關，以鉀離子通道為靶點來治療PD也成為一個重要的研究方向[19]。鉀離子通道廣泛存在于神經元、心肌細胞、骨骼肌細胞、紅細胞、平滑肌細胞和淋巴細胞等多種細胞中[20-21]。A型鉀通道是一種電壓依賴型鉀通道，又稱瞬時外向型鉀通道，在SN區DA能神經元上有廣泛的表達，可影響神經元的自發放電[22-24]。該通道介導的電流具有瞬時出現、快速激活、快速失活等特點[25-26]。A型鉀通道由Kv4基因家族形成的α亞基和KChip基因家族形成的輔助β亞基共同組成，其中在SN區DA能神經元上主要表達的是Kv4.3/KChip3.1[27-29]。然而，在PD的SN區DA能神經元退行性變過程中，A型鉀通道究竟發揮了何種作用尚不清楚。

本實驗選取α-Syn A53T+/+小鼠作為動物模型，該模型可用來研究PD發病過程中運動及非運動行為的改變[30]。本文研究結果顯示，3月齡的A53T轉基因小鼠SN區Kv4.3及TH蛋白的表達水平尚未發生明顯變化，提示3月齡的A53T轉基因小鼠SN區并無損傷，A型鉀通道也尚未發生變化。有文獻報道，3月齡A53T轉基因小鼠運動協調能力無明顯障礙，但認知功能出現一定程度的下降[31]。另有研究表明，A53T轉基因小鼠在8月齡時才出現明顯的總體運動功能障礙，表現為毛發梳理減少、移動減少，在12月齡時表現出步幅的縮短和速度的減慢[32-33]。本研究在15月齡的A53T轉基因小鼠SN區檢測到，Kv4.3蛋白的表達顯著升高，TH蛋白的表達顯著降低，說明SN區的DA能神經元出現了一定程度的損傷，A型鉀通道的表達也出現了異常，該結果與以往研究PD病人存活的SN區DA能神經元中Kv4.3 mRNA的表達顯著增加相吻合[16]。

鉀離子通道的表達及功能異常通過多種機制影響SN、紋狀體的功能，從而在PD的發病中發揮重要作用。例如，近期已有研究結果顯示，鈣激活型鉀通道KCa3.1在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD小鼠模型SN區表達顯著增加，基因敲除或用通道阻斷劑藥理干預能有效拮抗MPTP誘導的SN區DA能神經元損傷及紋狀體DA含量下降，減輕小膠質細胞增生所導致的炎癥反應[34]。ATP敏感性鉀通道（KATP）的SUR1亞單位在PD小鼠模型SN區的表達也顯著增高[35]，激活KATP可以導致DA能細胞內鐵含量增加，損傷線粒體功能并增加細胞氧化應激[36]。本實驗首次證明，在15月齡的A53T轉基因小鼠SN區A型鉀通道Kv4.3蛋白表達增加。A型鉀通道是調節SN區DA能神經元興奮性的關鍵因素，可影響突觸傳遞和神經遞質釋放。我們的前期研究已經觀察到，A型鉀通道阻斷劑4-氨基吡啶可以抑制A型鉀通道電流，增加SN區DA能神經元自發放電頻率[37];腹腔注射4-氨基吡啶能顯著縮短MPTP誘導的PD小鼠模型爬桿實驗中轉頭和爬桿的時間，改善PD小鼠的運動障礙[38]。因此，我們推測，在PD的進展過程中，A型鉀通道的表達及功能發生改變，影響SN區神經元的興奮性，進而改變了紋狀體DA的釋放，從而影響機體的運動功能。本實驗結果為闡明A型鉀通道參與PD發病提供了初步的實驗證據。

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（本文編輯 馬偉平）