淫羊藿素對LPS誘導原代皮質星形膠質細胞炎性反應影響

[摘要]目的 探討淫羊藿素（ICT）對脂多糖（LPS）誘導的原代皮質星形膠質細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因表達的影響及胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）阻斷劑JB-1的阻斷作用。方法 常規培養原代皮質星形膠質細胞，將其分為對照組、LPS組、ICT+LPS組和JB-1+ICT+LPS組。對照組和LPS組細胞分別給予體積分數0.01二甲基亞砜（DMSO）和1 mg/L的LPS處理，其余組在有或無JB-1（1 mg/L）預處理的情況下，給予ICT（10 μmol/L）預保護1 h，再加入1 mg/L的LPS共同作用6 h。應用實時熒光定量PCR檢測各組細胞TNF-α和iNOS基因的表達。結果 與對照組比較，LPS組TNF-α和iNOS基因表達明顯上調（F=81.98、118.60，q=20.41、25.22，P<0.01）;ICT預保護能明顯降低由LPS誘導的TNF-α和iNOS基因表達的上調（q=7.34、13.31，P<0.01），此作用可以被IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷（q=4.65、7.52，P<0.05）。結論ICT能夠抑制LPS誘導的原代皮質星形膠質細胞的炎性反應，其抗炎機制可能與IGF-1R途徑的激活有關。

[關鍵詞]淫羊藿素;脂多糖類;星形細胞;受體，IGF1型;腫瘤壞死因子α;一氧化氮合酶Ⅱ型

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0167-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of icaritin （ICT） on the gene expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and inducible nitric-oxide synthase （iNOS） in primary cultured cortical astrocytes induced by lipopolysaccharide （LPS） and the blocking effect of the insulin-like growth factor-1 receptor （IGF-1R） antagonist JB-1."Methods Primary cultured cortical astrocytes were obtained by conventional methods and were then divided into control group， LPS group， ICT+LPS group， and JB-1+ICT+LPS group. The astrocytes in the control group and the LPS group were treated with volume fraction 0.01 dimethyl sulfoxide and 1 mg/L LPS， respectively， and those in the other groups were pretreated with ICT （10 μmol/L） for 1 hour with or without JB-1 （1 mg/L）， followed by LPS （1 mg/L） treatment for another 6 hours. Quantitative real-time PCR was used to measure the gene expression of TNF-α and iNOS in each group."Results Compared with the control group， the LPS group had significantly upregulated gene expression of TNF-α and iNOS （F=81.98，118.60;q=20.41，25.22;Plt;0.01）. Pretreatment with ICT significantly inhibited LPS-induced upregulation of TNF-α and iNOS （q=7.34，13.31;Plt;0.01）， which was blocked by the IGF-1R antagonist JB-1 （q=4.65，7.52;Plt;0.05）."Conclusion ICT can inhibit LPS-induced inflammatory response in primary cultured cortical astrocytes， and its anti-inflammatory mechanism may be related to activation of the IGF-1R pathway.

[KEY WORDS]icaritin; lipopolysaccharides; astrocytes; receptor， IGF type 1; tumor necrosis factor-alpha; nitric oxide synthase type Ⅱ

星形膠質細胞是中樞神經系統中一種多功能的膠質細胞，與其他類型細胞相互作用發揮著多種生理功能[1-2]。近年來星形膠質細胞介導的炎癥反應在中樞神經系統中的作用被廣泛報道，有研究顯示，阿爾茨海默?。ˋD）病人大腦皮質淀粉樣斑塊周圍存在大量反應性星形膠質細胞[3-4]，并伴有一些促炎細胞因子或炎癥標志物的表達增加[3]。炎性因子及β-淀粉樣蛋白能夠直接誘導星形膠質細胞活化[5-6]，形成有害的神經炎癥循環。越來越多的研究表明，神經炎癥貫穿于AD發生發展的始終[7-8]。因此，針對星形膠質細胞介導的AD炎癥病理，開發有效的抗炎藥物，可能有助于減緩AD的發生發展。既往研究表明，傳統中藥淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷可以通過限制炎癥反應、氧化應激在AD病理中發揮神經保護效應[9-10]，而淫羊藿素（ICT）作為淫羊藿苷的代謝衍生物，也具有很強的抗炎作用[11-12]。研究已顯示，ICT能夠與雌激素受體（ER）結合，發揮類雌激素樣作用[13]。胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）介導的信號途徑參與大腦發育、突觸傳遞等功能[14]。ER與IGF-1R在神經元和神經膠質細胞中有廣泛的共表達[15-16]。有研究表明，IGF-1R可以與ER相互作用，協同促進人骨肉瘤細胞的增殖并抑制炎癥[17]。本實驗室前期的研究已經證實，10 μmol/L的ICT可以通過ER信號途徑對抗脂多糖（LPS）誘導的原代中腦星形膠質細胞的炎癥反應[18]，在整體動物水平，ICT能夠通過IGF-1R信號途徑抑制海馬炎癥反應[19]。但是IGF-1R信號通路是否參與ICT對抗LPS誘導的原代皮質星形膠質細胞的炎癥反應，目前尚不清楚。本研究應用LPS誘導原代皮質星形膠質細胞炎性反應，探討ICT對LPS誘導的細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因表達的影響以及JB-1的阻斷作用，以期為AD提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ICT購自上海同田生物公司，應用二甲基亞砜（DMSO）配制成10 mmol/L的溶液;LPS及JB-1購自Sigma公司，用無菌生理鹽水配制成1 g/L的溶液;DMEM/F12培養液和胎牛血清購自BI公司;青霉素/鏈霉素儲存液購自新華制藥廠，分裝后置于-20 ℃冰箱保存備用;多聚-D-賴氨酸（poly-D）購自Sigma公司;新生SD大鼠（<24 h）購自青島大任富城畜牧有限公司;TRIzol購自Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒以及SYBR Green購于Takara公司;引物由Takara公司設計并合成。

1.2 原代皮質星形膠質細胞培養及分組

在超凈工作臺中將新生SD大鼠斷頭，取腦，置于含有DMEM/F12基礎培養液的平皿中，在體式顯微鏡下分離大腦皮質，剝除腦膜和血管。用槍頭輕輕吹打，使腦組織呈離散狀態，收集細胞懸液至大離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有體積分數0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM/F12培養液，吹打混勻。接種于20 g/L poly-D包被的150 cm2培養瓶中，置于含體積分數0.05 CO2的37 ℃細胞培養箱中培養7～10 d，期間每隔2 d更換1次培養液。待細胞鋪滿瓶底，呈現明顯分層時，置于37 ℃恒溫搖床上，以210 r/min震蕩16～18 h后，棄掉上清，用DMEM/F12基礎培養液清洗細胞3次，加2.5 g/L胰蛋白酶消化1～3 min，用含血清的完全培養液終止消化。將貼于培養瓶上的細胞輕柔吹下，收集于大離心管中，以1 000 r/min離心5 min后，加入完全培養液后吹打混勻。將星形膠質細胞接種于6孔板中，在光鏡下觀察細胞融合度達到80%～90%時進行分組和加藥處理。將細胞隨機分為對照組（A組）、LPS組（B組）、ICT+LPS組（C組）以及JB-1+ICT+LPS組（D組）。對照組細胞給予體積分數0.01的DMSO處理;LPS組細胞則給予1 mg/L的LPS處理6 h;ICT+LPS組細胞給予LPS前先給予ICT（10 μmol/L）預保護1 h;JB-1+ICT+LPS組細胞先給予1 mg/L的JB-1作用1 h，繼而給予ICT（10 μmol/L）處理1 h，最后加入LPS共同作用6 h。

1.3 實時熒光定量PCR方法檢測TNF-α和iNOS的mRNA表達

應用TRIzol提取細胞總RNA，按照Takara反轉錄試劑盒要求配制兩步反應體系，經過42 ℃變性2 min，37 ℃反轉錄15 min，然后升溫至85 ℃，作用5 s使反轉錄酶失活，于4 ℃冷卻，將mRNA反轉錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測目的基因TNF-α、iNOS及內參照基因GAPDH表達，按照熒光定量PCR說明書配制PCR反應體系，采用兩步法經過40個循環完成擴增，采用2-△△CT法計算基因相對表達量。PCR擴增引物及其序列見表1。

1.4 統計學處理

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學處理。實驗結果以x2±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結 果

與對照組比較，LPS組原代皮質星形膠質細胞的TNF-α和iNOS基因表達明顯上調（F=81.98、118.60，q=20.41、25.22，P<0.01）;ICT預保護能明顯降低由LPS誘導的TNF-α和iNOS基因表達的上調（q=7.34、13.31，P<0.01），此作用可以被IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷（q=4.65、7.52，P<0.05）。見表2。

3 討 論

越來越多的研究表明，小膠質細胞和星形膠質細胞的漸進激活以及隨之而來的促炎因子的過度產生，是神經炎癥過程中的主要因素[20]。星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的膠質亞型[21-22]，可與神經元等多種類型細胞相互作用[23]。在許多AD轉基因小鼠模型中，常常在淀粉樣斑塊和（或）神經元纖維纏結這兩個病理學特征出現之前，觀察到激活的星形膠質細胞在皮質、海馬等受影響的腦區積聚[24-25]。并且體內研究發現，淀粉樣斑塊周圍的星形膠質細胞增生[26]，炎癥遞質在β-淀粉樣斑塊和神經原纖維纏結周圍高表達[27]。因此，抑制星形膠質細胞的炎癥反應，或許可以減緩AD的病理進程。

傳統中藥淫羊藿的成骨作用以及調節性功能、調節免疫系統的作用曾被廣泛報道，但是近年來人們認識到了其具有神經保護作用[28-29]。ICT是來源于淫羊藿的一種黃酮類化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理活性[30]。已有研究結果顯示，在小鼠腹腔巨噬細胞炎癥和腹膜炎模型中，ICT可以顯著減少iNOS、白細胞介素6（IL-6）等炎性因子的產生[11]，而在神經系統中ICT可以抑制LPS誘導的C57BL/6J小鼠的海馬神經炎癥[31]。為了探討ICT的抗炎神經保護作用，本研究利用LPS誘導原代培養的皮質星形膠質細胞炎癥反應，觀察ICT對LPS誘導的細胞TNF-α和iNOS基因表達的影響。結果顯示，LPS可明顯上調星形膠質細胞炎性因子TNF-α和iNOS的基因表達，應用ICT預保護可明顯抑制兩種炎性因子的基因表達。

IGF-1R主要表達于神經元和星形膠質細胞，是IGF-1的直接作用靶點，并且在皮質、海馬有較高水平的表達[32]。本課題組前期研究發現，激活IGF-1R信號通路可以抑制神經毒素對多巴胺能神經元的損傷[33]。為進一步探討IGF-1R信號通路是否參與了ICT抗皮質星形膠質細胞的炎癥反應，本研究觀察了IGF-1R特異性阻斷劑JB-1對ICT的阻斷效應，結果顯示JB-1預處理部分阻斷了ICT的抗炎保護作用。提示ICT的抗炎機制可能與IGF-1R信號途徑的激活有關，其他的信號途徑可能也參與了ICT的抗炎作用。

綜上所述，ICT能夠抑制LPS誘導的原代皮質星形膠質細胞TNF-α和iNOS的基因表達，其抗炎機制可能與IGF-1R信號通路的激活有關。本研究結果為ICT對抗神經炎癥提供了實驗依據。

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（本文編輯 馬偉平）