伊拉地平對Fe²⁺誘導MES23.5細胞毒性的作用

[摘要]目的 探討L型Ca2+通道阻斷劑伊拉地平對硫酸亞鐵誘導的MES23.5細胞毒性的作用。方法 以MES23.5多巴胺能細胞系為觀察對象，利用流式細胞儀篩選Fe2+最適濃度，伊拉地平則選用實驗室前期篩選濃度5 μmol/L。應用免疫印跡法（Western blot）檢測與凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，初步評估伊拉地平對Fe2+誘導的細胞毒性的保護作用。結果 與對照組相比，40 μmol/L Fe2+組線粒體膜電位（ΔΨm）明顯下降，差異具有統計學意義（F=68.190，q=8.898，P<0.001）。與對照組相比，單獨加Fe2+組細胞Bcl-2/Bax蛋白表達比值明顯降低（F=6.856，q=6.055，P<0.01），而伊拉地平預處理可改善由Fe2+造成的Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低的現象，差異具有統計學意義（q=4.103，P<0.05）。結論 伊拉地平預處理可以抑制Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低，對Fe2+誘導的細胞損傷可能具有保護作用。

[關鍵詞]伊拉地平;鈣通道阻滯藥;鐵;帕金森病;神經保護

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0190-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of isradipine， a blocker of L-type Ca2+ channels， on cytotoxicity induced by ferrous sulfate heptahydrate in MES23.5 cells."Methods The MES23.5 dopaminergic cell line was selected for observation. Flow cytometry was used to screen out the optimal concentration of Fe2+， and a concentration of 5 μmol/L was determined for isradipine in previous laboratory analysis. Western blot was used to measure the expression of the apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax， and the protective effect of isradipine against Fe2+-induced cytotoxicity was evaluated."Results Compared with the control group， the 40 μmol/L Fe2+ group had a significant reduction in mitochondrial membrane potential （ΔΨm） （F=68.190，q=8.898，Plt;0.001）. Compared with the control group， the Fe2+ alone group had a significant reduction in Bcl-2/Bax ratio （F=6.856，q=6.055，Plt;0.01）， while pretreatment with isradipine significantly improved the reduction in Bcl-2/Bax ratio caused by Fe2+ （q=4.103，Plt;0.05）."Conclusion Pretreatment with isradipine can inhibit the reduction in Bcl-2/Bax ratio and thus exert a protective effect against cell injury induced by Fe2+.

[KEY WORDS]isradipine; calcium channel blockers; iron; Parkinson disease; neuroprotection

帕金森病（PD）是一種常見的神經退行性老年疾病，其病理特征是黑質（SN）多巴胺（DA）能神經元進行性缺失以及由此引起的紋狀體DA含量的耗竭[1]。病人表現出靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩、姿勢平衡障礙等運動癥狀[2]，以及嗅覺障礙、抑郁、睡眠質量差和認知功能障礙等非運動癥狀[3]。雖然PD的發病機制尚未完全明確，但越來越多的證據表明SN區過量的鐵沉積是PD發病的關鍵因素之一[4-5]。在高鐵作用下，大腦中過量的Fe2+會通過Fenton和Haber-Weiss反應產生大量活性氧，從而引起蛋白質的異常聚集，損傷神經元，導致PD等神經退行性疾病的發生[6]。正常情況下，鐵主要是通過轉鐵蛋白和二價金屬轉運蛋白1（DMT1）等途徑進入細胞[7]，但在PD等病理條件下，轉鐵蛋白在腦脊液中處于飽和狀態，表明非轉鐵蛋白結合鐵發揮主要作用[8]，即L型Ca2+通道（LTCC）可能參與了鐵的異常聚集[9]。因此，本實驗探究了LTCC阻斷劑伊拉地平（ISR）對硫酸亞鐵誘導的MES23.5多巴胺能細胞毒性的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗所用細胞為MES23.5多巴胺能細胞系（是由大鼠胚胎中腦神經元與小鼠神經母細胞瘤膠質瘤細胞融合而成的雜交瘤細胞），由大連醫科大學附屬醫院樂衛東教授惠贈。胎牛血清（FBS），BI公司;DMEM/F12（1∶1）粉末，Gibco公司;多聚賴氨酸（poly-L），Sigma公司;青霉素/鏈霉素，索萊寶公司;二甲基亞砜（DMSO），Biosharp公司;硫酸亞鐵，Sigma公司;ISR，上海楊帆公司。

1.2 細胞培養

MES23.5多巴胺能細胞系用DMEM/F12培養液培養，該培養液中添加了10 mL的FBS、2 mL的青霉素/鏈霉素和4.4 mL的佐藤成分（含0.5 g/L胰島素和轉鐵蛋白）。實驗前，將細胞以1×108/L的密度接種在涂有poly-L的培養瓶或者6孔培養皿中。

1.3 Fe2+最適濃度篩選

應用不同濃度的硫酸亞鐵（0、20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+）處理MES23.5細胞，通過流式細胞儀檢測MES23.5多巴胺能細胞線粒體膜電位（ΔΨm）的變化。將細胞置于涂有poly-L的6孔板中培養2 d。以PBS洗滌3次后，使用1 mL羅丹明123（5 mg/L）在37 ℃培養箱中孵育30 min，然后通過300目的細胞濾網收集并制成單細胞懸液。上流式細胞儀檢測，設置門控區域M1和M2作為標記，使用Cell Quest軟件（BD Biosciences，美國）評估熒光強度的變化。

1.4 實驗分組

在確定Fe2+最適濃度的基礎上，后續實驗分為4組：對照組、Fe2+組、Fe2++ISR組、ISR組。將細胞以1×108/L的密度種在6孔板中。第3天行分組處理細胞：對照組用酸性培養液孵育5 h;Fe2+組先用酸性培養液孵育1 h，再使用Fe2+孵育4 h;Fe2++ISR組用ISR預孵育1 h，再使用Fe2+孵育4 h;ISR組用酸性培養液孵育5 h。ISR選用實驗室前期篩選濃度5 μmol/L。各組細胞置于37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱中培養。

1.5 免疫印跡法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達

細胞處理結束后，以PBS洗滌3次，每孔加入100 μL裂解液冰上裂解30 min。用刮板將細胞刮下，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。采用二辛可寧酸（BCA）法測定蛋白質濃度，計算十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣量。用SDS-PAGE（8 mL）分離每泳道包含40 μg蛋白樣品的細胞裂解液，將蛋白轉移到PVDF膜上。在室溫下用50 g/L的脫脂奶粉封閉2 h后，再加入Bcl-2、Bax（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床過夜。次日，使用TBST洗滌3次，加入與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。采用ECL法，通過化學發光的方式對抗原-抗體復合物進行可視化，然后使用Image J系統進行光密度分析。

1.6 統計學處理

使用Prism Graphpad 5.0軟件進行統計學處理。實驗所得結果以x2±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度Fe2+對MES23.5細胞ΔΨm的影響

用不同濃度的Fe2+處理MES23.5細胞24 h后，0、20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+處理組細胞的ΔΨm分別為0.01±1.66、-4.67±3.77、-10.17±3.34、-17.67±1.92、-21.50±2.29和-29.78±2.17（n=6）。與對照組細胞相比較，20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+處理組ΔΨm均有不同程度的降低（F=68.190，P<0.01），且ΔΨm降低呈濃度依賴性。若Fe2+對細胞毒性太小則損傷不夠，Fe2+對細胞毒性太大則造成細胞不可逆死亡，因此選取濃度40 μmol/L的Fe2+用于后續實驗。

2.2 各組細胞Bcl-2/Bax蛋白表達比值的比較

對照組、Fe2+組、Fe2++ISR組和ISR組細胞Bcl-2/Bax蛋白表達比值分別為1.04±0.12、0.82±0.03、0.97±0.12和0.99±0.08（n=4）。與對照組相比較，Fe2+組Bcl-2/Bax蛋白表達比值明顯降低（F=6.856，q=6.055，P<0.01）;ISR預處理可以明顯緩解由Fe2+誘導的Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低，差異具有統計學意義（q=4.103，P<0.05）;ISR組與對照組Bcl-2/Bax蛋白表達比值比較差異無顯著性（P>0.05）。

3 討 論

許多研究已經證實，鐵的積累是PD的一個標志[6]。有研究顯示，PD病人以及PD動物模型SN區DA能神經元內鐵水平較正常人或動物異常增高[10-11]。但是，尚不清楚SN中鐵蓄積的確切機制。眾所周知，鐵通過與轉鐵蛋白結合進入大腦[12]。但在鐵過載的情況下，轉鐵蛋白飽和，非轉鐵蛋白途徑顯得尤為重要[13]。因此，包括DMT1和鈣通道介導的鐵轉運在內的非轉鐵蛋白結合鐵（NTBI）途徑已引起更多關注[14]。有研究結果表明，鐵可以通過LTCC進入心肌細胞[15-16]，LTCC還介導鐵流入其他可興奮細胞，如胰腺β細胞[17]、腺垂體細胞[18]和神經元[19]。因此我們推測，在鐵負載情況下，在DA能神經元上廣泛表達的LTCC可能是鐵過量進入DA能神經元的重要替代路徑，而鐵的過量積累可能導致DA能神經元的損傷甚至死亡[20]。因此，LTCC阻滯劑可能通過阻斷鈣通道來緩解神經元中的鐵超負荷，成為PD的新治療方法。目前，LTCC參與PD的確切機制仍不清楚，LTCC是否直接參與SN區鐵的聚集也不清楚，因此深入探討PD發病過程中LTCC與Fe2+聚集的相關性，對了解DA能神經元的損傷機制十分重要。

LTCC主要以Cav1.2和Cav1.3亞型的形式存在于神經元中[21-22]，其相應的成孔亞基α1C以及α1D[23]在SN區DA能神經元中功能性表達[24]。研究表明，DA能神經元對Cav1.3鈣通道的異常依賴導致胞質內Ca2+水平升高，Ca2+進入細胞會持續刺激線粒體氧化磷酸化，這可能是PD中SN區DA能神經元更易受損的原因之一[25]。而Cav1.2鈣通道在平滑肌細胞[26]、神經元[27]、神經內分泌細胞[28]和感覺細胞等不同細胞中普遍表達[29-30]。有研究證實，在6-羥基多巴胺（6-OHDA）損傷的大鼠和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）處理的PD模型小鼠SN中，Cav1.2 α1亞基的表達顯著增加[23]。然而，迄今為止尚不清楚Cav1.2鈣通道對PD發病機制中鐵誘導的神經毒性的影響。而之前的研究報道，在鐵負載條件下，LTCC可能是鐵進入心肌細胞的主要途徑[31-32]。

本次研究首先利用不同濃度的Fe2+作用于MES23.5細胞[33]，通過流式細胞術觀察細胞ΔΨm的變化，結果顯示，Fe2+處理MES23.5細胞后，細胞△Ψm下降，提示線粒體功能受損。進一步的研究結果顯示，Fe2+組Bcl-2/Bax蛋白表達比值較對照組明顯降低，而5 μmol/L的ISR預處理部分逆轉了Fe2+誘導的Bcl-2/Bax蛋白表達比值的下降，表明LTCC可能參與了鐵積累引起的PD的發生。總之，以上結果表明，ISR可能會抑制Fe2+誘導的MES23.5細胞毒性，LTCC阻滯劑可能通過阻斷鈣通道來緩解神經元中的鐵超負荷。

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（本文編輯 馬偉平）