枸櫞酸鐵銨和鐵蛋白對原代培養腹側中腦神經元VMAT-2和DAT表達影響

[摘要]目的 探究枸櫞酸鐵銨（FAC）、含鐵鐵蛋白（Ferritin）和去鐵鐵蛋白（Apoferritin）對原代培養的腹側中腦神經元中單胺囊泡轉運蛋白-2（VMAT-2）和多巴胺轉運蛋白（DAT）表達的影響。方法 以FAC、Ferritin和Apoferritin處理原代培養的腹側中腦神經元24 h后，應用蛋白質免疫印跡（Western Blot）方法檢測神經元中VMAT-2和DAT的表達情況。結果 FAC、Ferritin和Apoferritin處理的原代腹側中腦神經元VMAT-2表達較對照組明顯降低，差異具有統計學意義（F=4.295，P<0.05），而DAT的表達沒有明顯變化。結論 FAC、Ferritin和Apoferritin能夠降低原代培養的腹側中腦神經元的VMAT-2表達，而對DAT表達沒有明顯影響。

[關鍵詞]鐵;鐵蛋白質類;中腦;神經元;囊泡單胺轉運蛋白質類;多巴胺質膜轉運蛋白質類

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0194-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ferric ammonium citrate （FAC）， Ferritin， and Apoferritin on the expression of vesicular monoamine transporter 2 （VMAT-2） and dopamine transporter （DAT） in primary cultured ventral midbrain neurons.Methods After primary cultured ventral midbrain neurons were treated with FAC， Ferritin， or Apoferritin for 24 h， Western blot was used to measure the expression of VMAT-2 and DAT in neurons."Results Compared with the control group， the group of primary cultured ventral midbrain neurons treated by FAC， Ferritin， or Apoferritin had a significant reduction in the expression of VMAT-2 （F=4.295，Plt;0.05）， while there was no significant change in the expression of DAT."Conclusion FAC， Ferritin， and Apoferritin can reduce the expression of VMAT-2 in primary cultured ventral midbrain neurons， with no significant effect on the expression of DAT.

[KEY WORDS]iron; ferritins; mesencephalon; neurons; vesicular monoamine transport proteins; dopamine plasma membrane transport proteins

帕金森病（PD）是第二大常見的神經系統退行性疾病，主要臨床表現有運動遲緩、靜止性震顫、姿勢反射障礙等[1-3]。其病理性特征是黑質（SN）多巴胺（DA）能神經元進行性缺失[4]。迄今為止PD的病因尚未完全闡明，越來越多的證據表明，SN鐵的過度沉積可能是PD發病的關鍵因素之一[5-13]。SN鐵增加會產生活性氧和活性氮物質，刺激細胞內α-突觸核蛋白形成，導致DA能神經元變性[14-15]。在腦內鐵主要與鐵蛋白結合，鐵蛋白是一種可儲存多達4 500個鐵原子的蛋白質[16-17]，有含鐵鐵蛋白（Ferritin）和去鐵鐵蛋白（Apoferritin）兩種形式[18]。有研究表明，鐵蛋白可能不僅是細胞內的鐵儲存者，也可能是參與組織和全身鐵調控的重要因素[19]。但鐵蛋白在DA穩態中起的作用尚不明確。

單胺囊泡轉運蛋白-2（VMAT-2）是位于DA能神經元突觸囊泡的一種膜蛋白，可以將胞漿內游離的DA轉運到囊泡內，并調節隨后的釋放。它通過向單胺能神經元傳遞DA小泡來保護DA能神經元[20]。多巴胺轉運蛋白（DAT）在SN神經元胞體和樹突中大量表達[21-23]，可將DA從細胞外迅速轉運到突觸前神經元胞質內，以維持細胞內外DA穩態。但是在高鐵以及存在外源性鐵蛋白的狀態下，原代培養腹側中腦神經元中VMAT-2和DAT的表達是否改變尚不清楚。本實驗旨在探究高鐵、Ferritin和Apoferritin對原代培養的腹側中腦神經元VMAT-2和DAT表達的影響。現將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原代培養的腹側中腦神經元細胞（取自孕14 d的Wistar大鼠的胎鼠腹側中腦），DMEM/F12培養液、2.5 g/L的胰酶（美國Hyclone公司），B27營養因子、胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素溶液（100×，中國索萊寶科技有限公司），D-多聚賴氨酸、枸櫞酸鐵銨（FAC）、Ferritin、Apoferritin（美國Sigma公司），VMAT-2抗體和DAT抗體（中國上海Abcam公司），ECL發光液（Millipore公司）。

1.2 原代腹側中腦神經元的培養

實驗前將實驗器械進行高壓處理，提前3 h用D-多聚賴氨酸鋪培養板，以高壓滅菌水清洗3次放置超凈臺內備用。將孕14 d的Wistar大鼠以聯合麻醉藥深度麻醉后，用體積分數0.75的乙醇進行腹部消毒，沿中線剪開，取出串珠樣胚胎，放置在預冷的DMEM/F12培養液中。將胚胎移至超凈臺中顯微鏡下，在冰上操作，剖開胚胎外膜取出胎鼠置于另一裝有DMEM/F12培養液的玻璃皿中。使用眼科鑷、眼科剪將中腦部分取出，去除端腦及血管膜，修剪組織留出蝴蝶狀的腹側中腦，將其轉移至含預冷DMEM/F12培養液的玻璃皿中。去除DMEM/F12培養液，加入37 ℃預溫的2.5 g/L胰酶，在培養箱中消化5 min。加入含有胎牛血清的終止液終止消化。用移液器將組織吹打成單細胞懸液，用藍槍頭吹打約10次，收集單細胞懸液至50 mL離心管中，后套用黃槍頭和白槍頭重復上述操作。將裝有單細胞懸液的離心管以1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入含有B27和雙抗的DMEM/F12培養液，用吸管吹打成細胞懸液，以2×108/L的密度種板。此后每隔2 d換1次液，第6天細胞成熟可用于實驗。

1.3 實驗分組及處理

實驗分為對照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組，將原代培養的腹側中腦神經元培養液換成DMEM/F12基礎培養液，對照組細胞只用DMEM/F12基礎培養液孵育，FAC處理組細胞加入100 μmol/L的FAC，Ferritin處理組細胞加入80 μmol/L的Ferritin，Apoferritin處理組細胞加入50 μmol/L的Apoferritin。將各組細胞置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中孵育24 h。

1.4 VMAT-2和DAT的蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測

在6孔板中加入100 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，用刮板將板底的細胞刮下，用移液器轉移至1.5 mL的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。用移液器吸取80 μL上清至另一EP管中，使用BCA試劑盒檢測上清中蛋白質濃度，加入5×Loading Buffer，95 ℃煮5 min。按照BCA試劑盒檢測的蛋白濃度計算SDS-PAGE凝膠電泳的上樣量。加入樣品后，調節電壓至80 V，待樣品進入分離膠后，將電壓調至120 V，電泳之后將蛋白轉至PVDF膜上，以300 mA濕轉90 min，切下所需分子量的條帶，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h后，再加入用含50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋的VMAT-2抗體（稀釋度為1∶1 000）、DAT抗體（稀釋度為1∶1 000）和β-actin抗體（稀釋度為1∶10 000）孵育相應的條帶，4 ℃搖床過夜。用TBST洗條帶3次，每次10 min，加入HRP偶聯的山羊抗兔二抗（稀釋度為1∶10 000），室溫孵育1 h，孵育完成后以TBST洗3次，每次10 min。加ECL發光液避光孵育1 min顯影。利用Image J軟件對條帶進行分析，以目的條帶與內參照條帶的比值作為目的蛋白的相對含量。

1.5 統計學處理

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學處理，計量資料結果以x2±s的形式表示，多組比較采用單因素方差分析（One way ANOVA檢驗），并繼以Tukey法進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FAC、Ferritin和Apoferritin對原代培養的腹側中腦神經元VMAT-2表達的影響

對照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組細胞內的VMAT-2蛋白表達水平分別為1.175±0.075、0.938±0.044、0.945±0.046和0.921±0.062（n=17）。與對照組相比，FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組VMAT-2蛋白表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（F=4.295，q=3.952～4.370，P<0.05），而Ferritin處理組與Apoferritin處理組相比差異無顯著意義（q=0.417，P>0.05）。

2.2 FAC、Ferritin和Apoferritin對原代培養的腹側中腦神經元DAT表達的影響

對照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組細胞內DAT蛋白表達水平分別為0.910±0.055、0.931±0.679、0.937±0.056、0.958±0.088（n=12），各組間比較，差異均無顯著性（F=0.084，q=0.297～0.706，P>0.05）。

3 討 論

PD是全球第二大神經退行性疾病，其發病與年齡老化、氧化應激、炎癥反應、環境因素、遺傳因素等有關。越來越多的證據表明，SN鐵過度沉積參與了PD的發病，過多的鐵激活的小膠質細胞會釋放大量的神經炎性因子，增加了DA能神經元的變性[24]。在腦內，鐵主要與鐵蛋白結合，鐵蛋白兩種亞型以互補的方式儲存細胞內的鐵[25]。

有研究提出DA作用的區域概念，VMAT-2和DAT在調節這些區域之間DA轉移中起著核心作用[26-27]。VMAT-2將突觸前神經元合成的DA攝取到突觸囊泡中，釋放到突觸間隙，從而作用到相應的受體。而DAT可以將突觸間隙的DA重新攝取到突觸前神經元。它們共同調節DA活性，從而改變DA的含量[28]。本文研究結果顯示，給予高鐵會導致原代培養的腹側中腦神經元的VMAT-2表達降低。有實驗研究表明，當VMAT-2水平降低約95%時，小鼠表現為DA穩態失調，而且神經元對多種有毒化合物的敏感性增強[29-34]。這提示高鐵導致的VMAT-2表達降低可能影響了DA的釋放，從而引起DA穩態失調。本文結果還顯示，給予鐵蛋白后，細胞VMAT-2的表達也會下降，說明腹側中腦神經元VMAT-2的表達變化不是鐵依賴性的，鐵蛋白和鐵均可通過影響VMAT-2的表達參與DA穩態調控。Western Blot結果顯示，經高鐵及鐵蛋白處理的腹側中腦神經元DAT的表達沒有發生明顯變化，提示高鐵及鐵蛋白并不影響DA重新攝取到突觸前神經元。以上結果提示，高鐵及鐵蛋白能夠減少突觸前神經元的DA釋放，但并不影響DAT介導的DA重新攝取，這就導致了DA的穩態失調，可能增加了神經元對有毒物質的敏感性。本實驗以原代細胞為模型，更好地探究了高鐵誘導的DA代謝和轉運情況，為開發影響DA穩態的鐵螯合劑提供了新的依據，也為PD的治療提供了新的思路。

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（本文編輯 馬偉平）