異氟烷預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及機制

[摘要]目的 探討異氟烷（ISO）預處理對腦缺血再灌注（I/R）損傷的影響及其機制。方法 用線栓法構建I/R模型，將50只大鼠隨機分為5組：假手術組（A組）、I/R組（B組）、I/R+ISO組（C組）、I/R+ISO+吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）組（D組）和I/R+ISO+二甲基亞砜（DMSO）組（E組），每組10只。用Longa評分法評估各組大鼠神經功能損傷評分和TMS評分，TTC法檢測腦組織梗死面積，TUNEL法檢測神經細胞凋亡率，ELISA法檢測腦組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）的含量，Western blot檢測腦組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3和NF-κB p65蛋白的表達。結果 與A組相比較，B、C、D和E組的TMS評分、Bcl-2表達水平均明顯降低，而神經功能損傷評分、神經細胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達水平、TNF-α和IL-1β含量均明顯升高（Plt;0.05）。與B組相比，C、D和E組以上各指標有不同程度的逆轉（Plt;0.05）。而C組和D組比較、C組與E組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。結論 ISO預處理可保護腦I/R損傷，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路減少神經細胞凋亡和減輕炎癥反應有關。

[關鍵詞]再灌注損傷;腦梗死;異氟醚;細胞凋亡;炎癥;NF-κB信號通路;大鼠

[中圖分類號]R977.6;R364.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0255-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect and mechanism of isoflurane （ISO） preconditioning on cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury. "Methods The suture method was used to establish an I/R model， and 50 rats were randomly divided into sham-operation group （group A）， I/R group （group B）， I/R+ISO group （group C）， I/R+ISO+pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） group （group D）， and I/R+ISO+dimethyl sulfoxide （DMSO） group （group E）， with 10 rats in each group. The Longa scoring method was used to evaluate the neurological deficit score of each group; the TTC method was used to measure brain infarct area; the TUNEL method was used to measure the apoptosis rate of neural cells; the ELISA method was used to measure the content of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in brain tissue; Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2， cleaved caspase-3， and NF-κB p65 in brain tissue. "Results Compared with group A， groups B， C， D， and E had significant reductions in TMS score and the expression level of Bcl-2 and significant increases in neurological deficit score， apoptosis rate of neural cells， brain infarct area， expression levels of NF-κB p65 and cleaved caspase-3， and levels of TNF-α and IL-1β （Plt;0.05）. Compared with group B， groups C， D， and E had varying degrees of reversal of the above indices （Plt;0.05）. There were no significant differences between group C and group D and between group C and group E （Pgt;0.05）."Conclusion ISO pretreatment can protect the brain against I/R injury， possibly by inhibiting the NF-κB signaling pathway to reduce neural cell apoptosis and alleviate inflammatory response.

[KEY WORDS]reperfusion injury; brain infarction; isoflurane; apoptosis; inflammation; NF-kappa B signaling pathway; rats

腦缺血再灌注（I/R）損傷是一種由多種因素引起的病理過程，與腦細胞凋亡和炎癥反應等密切相關[1-3]。NF-κB信號通路是一種與細胞凋亡和炎癥反應關系密切的經典信號傳導途徑[4-6]。有研究發現，異氟烷（ISO）預處理可通過抑制腦細胞凋亡和減弱炎癥反應等機制改善腦I/R損傷[7-8]。但NF-κB信號通路是否與ISO的保護機制有關尚不清楚。因此，本研究旨在探究ISO對I/R損傷的影響以及對NF-κB信號通路的調控作用。本研究利用NF-κB信號通路抑制劑，通過觀察ISO對I/R大鼠腦細胞凋亡、炎癥反應及NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響，探討ISO保護腦I/R損傷的作用機制是否與NF-κB信號通路有關。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD雄性大鼠（體質量260～300 g，2～3周齡）購于空軍軍醫大學實驗動物中心，ISO購于美國Baxter公司。細胞裂解液、硝酸纖維素膜、顯影液、定影液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所，NF-κB p65兔多克隆抗體購于美國MILLIPORE公司，B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗體和兔源二抗購于美國Cell Signaling公司。NF-κB信號通路抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）購于美國Sigma公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購于德國Ramp;D Germany公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 I/R模型的制備、ISO預處理與實驗分組

I/R模型的制備：以腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉的方法麻醉大鼠，固定大鼠去除頸前毛，并以體積分數0.75乙醇溶液對頸部皮膚進行消毒。在頸正中做切口，分離右側頸總動脈以及頸內外動脈，將尼龍線栓（直徑0.38 mm）從頸外動脈殘端插入頸內動脈（約長20 mm）直至有阻力感。在缺血90 min后，拔出線栓，進行再灌注24 h。I/R大鼠模型制備成功的判斷參照LONGA等[9]的標準。預處理方法：ISO組在I/R前進行ISO預處理，將大鼠置于自制密閉的實驗艙中，頭端分別連接進氣孔和連接麻醉氣體監測儀。維持箱內溫度35～37 ℃，經麻醉機輸送體積分數0.015的ISO氣體至實驗艙內，并調節氧體積分數為0.70左右，逐漸升高麻醉氣體濃度，根據Datex氣體檢測儀調節實驗艙內ISO濃度為體積分數0.015時，維持以上濃度穩定15 min后放入大鼠進行預處理。連續5 d吸入體積分數0.015的ISO氣體，每天1 h。吸入ISO氣體過程中分別監測脈搏氧分壓（SpO2）和脈率。末次預處理24 h后行I/R。

實驗分組：將50只大鼠隨機分為5組，每組10只。①假手術組（A組）：分離血管后不插入線栓。②I/R組（B組）：參照I/R模型的制備方法制備腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型，在缺血90 min后再灌注。③I/R+ISO組（C組）：在缺血前60 min給予體積分數0.02的ISO誘導30 min，之后行I/R。④I/R+ISO+PDTC組（D組）：缺血前60 min給予體積分數0.02的ISO誘導30 min，并于側腦注射10 μL的NF-κB信號通路特異性抑制劑PDTC（以二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.3 mg/kg），然后再行I/R。⑤I/R+ISO+DMSO組（E組）：缺血前60 min給予體積分數0.02的ISO誘導30 min，并于側腦注射10 μL的DMSO，再行I/R。

1.2.2 神經功能損傷和TMS評分 采用Longa評分法對缺血再灌注后24 h的各組大鼠進行神經功能評估。神經功能損傷評分：無神經損傷記為0分，左前肢出現伸展障礙記為1分，向左打圈記為2分，行走時向左側傾斜記為3分，意識昏迷記為4分，死亡記為5分;評分越高神經功能損傷程度越嚴重。TMS評分：各組大鼠在再灌注后2 h進行TMS評分，參照LONGA等[9]報道的方法對大鼠抓屏、抓繩和平衡木等3個項目的檢測，評分越高表明神經運動功能越好。

1.2.3 TTC法檢測梗死面積 在各組大鼠處理結束后，脫臼處死大鼠。取腦組織，并做厚度為2 mm的冠狀組織切片，以10 g/L的TC溶液染色15～20 min，其中呈紅色的為正常腦組織，呈白色的為梗死區域腦組織。以40 g/L多聚甲醛進行固定。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對染色切片進行分析。梗死面積（%）=白色區域面積/（白色區域面積+紅色區域面積）×100%。

1.2.4 TUNEL法檢測神經細胞凋亡 采用40 g/L多聚甲醛對各組大鼠腦組織固定后，以石蠟進行包埋切片。根據TUNEL試劑盒說明書步驟進行染色。其中，呈綠色熒光的為陽性細胞。在400倍光鏡下隨機選取5個視野統計陽性細胞數，以陽性細胞數與總細胞數的比值表示神經細胞的凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表達 向各組腦組織勻漿中加入細胞裂解液提取總蛋白，經BCA法定量總蛋白后，將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳。待完全分離后，結束電泳。恒流轉至硝酸纖維素膜后，加入1∶1 000的特異性一抗（NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3）4 ℃下孵育2 h。次日，加入1∶2 000的辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h。暗室內顯影曝光后，以GAPDH為對照，采用凝膠成像系統掃描分析。

1.2.6 ELISA法檢測腦組織中TNF-α和IL-1β的含量 取各組大鼠的腦組織制備勻漿，嚴格參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測各組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以x2±s形式表示，多組組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經功能的比較

與假手術組比較，其余4組的神經功能損傷評分明顯升高，而TMS評分明顯降低（F=38.626、404.130，Plt;0.05）;與I/R組相比，I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組的神經功能損傷評分均明顯降低，而TMS評分明顯升高（q=7.776～15.231，Plt;0.05）;與I/R+ISO組相比，I/R+ISO+PDTC組的神經功能損傷評分明顯降低，而TMS評分明顯升高（q=4.030、12.124，Plt;0.05），但I/R+ISO+DMSO組無顯著差異（q=0.403、0.501，Pgt;0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠神經細胞凋亡率與腦組織梗死面積的比較

I/R組、I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經細胞凋亡率和腦組織梗死面積較假手術組均明顯升高（F=111.952、272.910，Plt;0.05）。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經細胞凋亡率和腦組織梗死面積較I/R組均明顯降低（q=11.361～19.237，Plt;0.05）;并且，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組（q=5.248、9.211，Plt;0.05），而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著意義（q=1.040、1.348，Pgt;0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2以及Cleaved Caspase-3蛋白表達的比較

與假手術組大鼠相比，其余4組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平均明顯升高，而Bcl-2蛋白的表達水平均明顯降低（F=43.929～114.750，Plt;0.05）。同時，與I/R組相比，除假手術組外的另外3組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高（q=9.192～12.328，Plt;0.05）;并且，在I/R+ISO+PDTC組中上述變化幅度明顯小于I/R+ISO組（q=5.527～9.900，Plt;0.05），而I/R+ISO組與I/R+ISO+DMSO組無顯著差異（q=0.850～1.414，Pgt;0.05）。見圖1和表3。

2.4 各組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量的比較

與假手術組相比，其余4組中TNF-α和IL-1β含量均明顯升高（F=20.613、30.197，Plt;0.05）。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組中TNF-α和IL-1β含量較I/R組均明顯降低（q=5.244～7.381，Plt;0.05）。同時，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組（q=3.580、3.628，Plt;0.05），而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著性（q=0.218、0.636，Pgt;0.05）。見表4。

3 討 論

在I/R過程中，中性粒細胞和內皮細胞等可通過釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子啟動炎癥反應的發生，加重細胞損傷，而炎癥因子的釋放受多種信號通路調控[10-13]。另外，神經細胞凋亡是導致腦I/R損傷的重要環節，而信號轉導是介導細胞凋亡啟動的重要前提[14-15]。因此，尋找有效抑制細胞凋亡和改善炎癥反應的信號靶點對減輕腦I/R損傷具有重要意義。

眾所周知，NF-κB是廣泛存在于細胞內的多效核轉錄因子，p65是其重要的功能性亞單位，翻譯后修飾能夠精細地激活NF-κB信號通路，進而調控多種細胞基因，參與細胞的增殖、遷移、凋亡、炎癥和免疫反應等過程[16-17]。目前多項研究顯示，NF-κB與中樞神經系統疾病、腫瘤和心血管疾病等多種疾病的發生發展密切相關[18-20]，是多種藥物介入方面潛在的靶標。

ISO是一種揮發性麻醉劑，一項研究證實ISO預處理可通過激活Akt/mTOR/s6K信號通路減輕I/R損傷誘導的神經功能缺損、梗死體積、腦水腫和細胞凋亡等[7]。PENG等[21]指出，ISO通過TGF-β2/Smad3信號通路增強VEGF和CD34的活化來減輕I/R損傷。此外，ISO還能夠有效緩解大鼠腦I/R損傷[22]。ZHAO等[23]研究結果顯示，在腦I/R損傷后大鼠腦組織中NF-κB信號通路被激活，腦梗死體積增大和病理改變加重，神經功能障礙明顯，而

抑制NF-κB信號通路后，大鼠腦I/R損傷可明顯減輕。ZHANG等[24]研究顯示，脂聯素通過抑制海馬中的P38-MAPK信號通路來改善ISO引起的老年大鼠認知功能障礙。另一項研究顯示，ISO誘導CUMS小鼠中BDNF-TrkB信號傳導產生抗抑郁作用[25]。以上研究提示，ISO能夠調控不同信號通路在多種疾病中發揮作用。

本研究通過構建I/R損傷大鼠模型，ISO預處理后I/R損傷大鼠TMS評分、Bcl-2表達水平均明顯升高，而神經功能損傷評分、神經細胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達水平、TNF-α和IL-1β含量均明顯降低。Bcl-2是公認的抑凋亡基因，Caspase-3是凋亡的關鍵執行因子，活化的Caspase-3以Cleaved Caspase-3形式存在;兩者均在腦I/R損傷的細胞凋亡過程中發揮著重要作用[26-27]。本文結果提示，ISO預處理可通過抑制神經細胞凋亡和減弱炎癥反應以發揮保護腦I/R損傷的作用。而以NF-κB信號通路抑制劑PDTC作用后，I/R損傷大鼠的TMS評分、Bcl-2表達水平均進一步升高，而神經功能損傷評分、神經細胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達水平、TNF-α和IL-1β含量進一步降低。本文研究結果表明，ISO對腦I/R損傷的保護作用進一步增強。提示，ISO可通過抑制NF-κB信號通路減少神經細胞凋亡和減輕炎癥反應，進而減輕腦I/R損傷發揮神經保護作用。

綜上所述，NF-κB信號通路在腦I/R損傷過程中發揮著重要作用，ISO預處理可通過抑制其激活抑制神經細胞凋亡和炎癥反應來減輕腦I/R損傷。本研究為腦I/R損傷發病機制的深入研究提供實驗依據，并為ISO用于腦I/R損傷治療提供一定的理論基礎。然而，本實驗未涉及ISO是否調控其他信號通路尚顯不足，后續研究將對此進行補充和完善，且大鼠體內實驗與臨床試驗也有一定差距，ISO用于腦I/R損傷治療仍然需要大量的研究。

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（本文編輯 于國藝）