HDAC9基因對LPS誘導冠狀動脈平滑肌細胞增殖與凋亡及炎癥反應影響

[摘要]目的 探討蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）基因對脂多糖（LPS）誘導的人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）增殖、凋亡及炎癥反應的影響。方法 采用LPS誘導HCASMC，實驗分為空白對照組、模型組、陰性對照組和轉染組。采用實時熒光定量PCR（qPCR）和Western blot方法檢測HDAC9 mRNA和蛋白表達;MTT法和流式細胞術分別檢測細胞增殖和凋亡情況;ELISA檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-8（IL-8）含量。結果 與空白對照組相比，模型組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，P<0.05）、細胞活力升高（F=77.940，q=17.819，P<0.05）、凋亡率降低（F=98.321，q=15.563，P<0.05）、TNF-α與IL-1β及IL-8的含量增多（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，P<0.05）。敲低HDAC9能夠抑制細胞活力和炎癥反應，并促進細胞凋亡。結論 敲低HDAC9可抑制LPS誘導的HCASMC增殖及炎癥反應，并促進細胞凋亡。

[關鍵詞]組蛋白脫乙酰基酶類;基因敲低技術;冠狀血管;肌細胞，平滑肌;細胞增殖;細胞凋亡;炎癥

[中圖分類號]R345.61;R322.12

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0260-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the protein deacetylase 9 （HDAC9） gene on lipopolysaccharide （LPS）-induced proliferation， apoptosis， and inflammatory response of human coronary artery smooth muscle cells （HCASMCs）. "Me-thods HCASMCs were induced by LPS， and the cells were divided into blank control group， model group， negative control group， and transfection group. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of HDAC9; MTT assay and flow cytometry were used to measure cell proliferation and apoptosis; ELISA was used to mea-sure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-8 （IL-8）. "Results Compared with the blank control group， the model group had significant increases in the mRNA and protein expression levels of HDAC9 in cells （F=91.145-185.108，q=19.403-25.646，Plt;0.05）， a significant increase in cell viability （F=77.940，q=17.819，Plt;0.05）， a significant reduction in cell apoptosis rate （F=98.321，q=15.563，Plt;0.05）， and significant increases in the levels of TNF-α， IL-1β， and IL-8 （F=91.145-325.808，q=10.813-15.180，Plt;0.05）. HDAC9 knockdown inhibited cell viability and inflammatory response and promoted cell apoptosis.

Conclusion HDAC9 knockdown can inhibit LPS-induced proliferation and inflammation of HCASMCs and promote cell apoptosis.

[KEY WORDS]histone deacetylases; gene knockdown techniques; coronary vessels; myocytes， smooth muscle; cell proli-feration; apoptosis; inflammation

冠心病是由動脈粥樣硬化（AS）引起的心腦血管疾病，嚴重影響人類的健康和生命[1]。業已證實，冠心病是一種慢性炎癥性疾病[2]。有證據表明，血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和凋亡失衡是AS發展的關鍵步驟[3]。蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）屬于HDAC家族成員，HDAC9參與心血管疾病發生和發展[4-6]。而人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）在外界因子刺激下增殖和凋亡能夠參與AS的發病過程[7]。目前，有關HDAC9基因與HCASMC關系的研究鮮有報道。因此，本文探究HDAC9基因對脂多糖（LPS）誘導HCASMC增殖、凋亡及炎癥反應的影響，以期為冠心病的治療提供新的靶點。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）購自美國Lifeline公司;DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）購自賽默飛世爾科技有限公司;噻唑藍（MTT）試劑和Lipofectamine 2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司;二甲基亞砜購自北京索萊寶科技有限公司;LPS購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒和SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒均購自日本TaKaRa公司;HDAC9 siRNA及陰性對照（siRNA Control）購自上海吉瑪制藥技術有限公司;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-8（IL-8）ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒及Western blot檢測所需試劑均購自上海碧云天生物技術研究所;HDAC9抗體、β-actin抗體及辣根過氧化酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HCASMC復蘇后接種到含有體積分數0.10 FBS的DMEM高糖培養基的培養瓶中，將其放置于體積分數0.05 CO2、37 ℃培養箱中培養，每隔1 d更換1次新鮮培養液，待細胞貼壁生長融合度達到90%時，使用胰蛋白酶消化細胞，按照1∶3進行傳代。取對數生長期的HCASMC進行后續實驗。

1.2.2 細胞處理和實驗分組 取對數生長期的HCASMC以胰蛋白酶消化，收集細胞接種到6孔板中，待細胞單層融合時進行處理。實驗分為4組：空白對照組（A組，未做處理），模型組（B組，以1 mg/L的LPS處理48 h），陰性對照組（C組，轉染siRNA Control后以1 mg/L的LPS處理48 h），轉染組（D組，轉染HDAC9 siRNA后以1 mg/L的LPS處理48 h）。每組細胞設置3個復孔。細胞轉染嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行，LPS處理HCASMC的濃度和時間參考文獻方法[8-9]及預實驗結果，各組細胞處理48 h后進行相應指標檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測HDAC9 mRNA表達水平 采用Trizol試劑分別提取各組HCASMC中總RNA，以RNA為模板使用逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，再以cDNA為模板使用SYBR premix Ex Taq PCR Kit檢測試劑盒進行qRT-PCR檢測。反應體系包括：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR 10 μL，ddH2O 6 μL，避光加樣。短暫離心后放置在熒光定量PCR儀中進行反應，程序設置為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，共設40個循環。以β-actin為內參照，用相對定量2-△△CT法計算HDAC9 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western blot檢測HDAC9蛋白的表達水平

收集各組處理48 h后HCASMC，加入適量細胞裂解液，置冰上裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進行定量。取40 μg蛋白樣品進行加樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結束后轉膜，在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，分別加入1∶500稀釋的HDAC9一抗，4 ℃過夜雜交，再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL化學發光方法顯影和定影后，使用凝膠成像系統拍照，以β-actin進行標定，采用Image J軟件對各條帶灰度值進行分析，計算各組HCASMC中HDAC9蛋白相對表達水平。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期的HCASMC接種到96孔板中，按照上述1.2.2方法分組和處理，每組設置4個復孔，48 h后向各孔細胞中分別添加20 μL 的MTT溶液，37 ℃培養箱中繼續培養4 h。取出96孔板，棄上清液，再向細胞中加入150 μL二甲基亞砜，放置在震蕩儀上低速振蕩10 min，待還原物充分溶解以后，在酶標儀上測定450 nm波長處吸光度值（A值）。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 處理48 h后各組HCASMC加入胰蛋白酶消化，收集細胞，首先加入Annexin V-FITC重懸細胞，然后加入PI染液，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min，隨機上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 ELISA檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量 各組HCASMC處理48 h后，分別收集細胞培養上清液，參照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA檢測試劑盒說明書測定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料數據均以x2±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析。以Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 LPS誘導HCASMC中HDAC9的表達

qRT-PCR和Western blot方法分別檢測各組HCASMC中HDAC9的mRNA和蛋白表達結果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比，轉染組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平均明顯下調（q=13.393～20.714，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組兩組相比，細胞中HDAC9的mRNA和蛋白表達水平均無明顯變化（P均>0.05）。提示LPS能夠誘導HCASMC中HDAC9的表達，轉染HDAC9 siRNA能夠成功敲低HCASMC中HDAC9的表達。見圖1和表1。

2.2 敲低HDAC9表達對LPS誘導HCASMC活力的影響

MTT檢測的結果表明，空白對照組、模型組、陰性對照組、轉染組細胞的A值分別為0.35±0.03、0.56±0.04、0.55±0.04和0.41±0.03。與空白對照組相比，模型組HCASMC 的A值明顯升高（F=77.940，q=17.819，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比，轉染組HCASMC的A值明顯降低（q=12.728、11.879，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比，HCASMC的A值無明顯改變（P>0.05）。提示LPS能夠提高HCASMC活力，敲低HDAC9基因表達能夠抑制LPS誘導的HCASMC活力增加。

2.3 敲低HDAC9表達對LPS誘導HCASMC凋亡的影響

流式細胞術檢測結果表明，空白對照組、模型組、陰性對照組、轉染組HCASMC凋亡率分別為（6.64±0.74）%、（2.37±0.26）%、（2.56±0.28）%和（7.61±1.42）%。與空白對照組細胞相比較，模型組HCASMC凋亡率明顯降低（F=98.321，q=15.563，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組細胞相比，轉染組HCASMC凋亡率明顯升高（q=19.098、18.406，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比較，HCASMC的凋亡率無顯著變化（P>0.05）。提示LPS可阻礙HCASMC凋亡，而敲低HDAC9基因表達能促進LPS誘導的HCASMC凋亡。見圖2。

2.4 敲低HDAC9基因表達對LPS誘導的炎癥因子分泌的影響

ELISA檢測培養上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量顯示，與空白對照組相比，模型組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯升高（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比較，轉染組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量均明顯降低（q=7.826～8.941，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量無明顯變化（P>0.05）。提示LPS可誘導HCASMC分泌炎癥因子，而敲低HDAC9基因表達能夠抑制LPS誘導的炎癥因子的表達。見表2。

3 討 論

冠心病是一種慢性炎癥性疾病。研究表明，內皮細胞、VSMCs和炎癥細胞參與冠心病的病理過程[10-15]。VSMCs的增殖失控及凋亡抑制在內膜增厚過程中起重要作用，是冠心病的重要致病機制。大量研究結果已證實，內皮細胞參與動脈粥樣硬化過程[16-20]。因此，本實驗選取HCASMC為載體，以探究冠心病的發病機制。近年來的研究結果已顯示，體外VSMCs增殖受多種生長因子的刺激，如血管緊張素Ⅱ、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、脂多糖（LPS）、轉化生長因子-β（TGF）-β和成纖維細胞生長因子等[21-25]。因此，本實驗結合以往研究以LPS誘導HCASMC進行造模，以探究HDAC9基因對LPS誘導HCASMC增殖、凋亡和炎癥反應影響。本文研究結果顯示，LPS能夠上調HCASMC活力，抑制HCASMC凋亡，促進炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8等分泌誘導炎癥反應，這些結果與以往研究一致。此外，LPS能夠上調HCASMC中HDAC9基因的表達。

HDAC9基因位于染色體7p21上，該基因屬于HDAC家族，在心肌、骨骼肌、胎盤等組織中均有表達。靳洲等[26]報道，HDAC9通過促進AS在大動脈粥樣硬化型腦梗死中發揮重要作用。成海鵬[27]的研究結果顯示，沉默HDAC9基因能夠促進炎癥因子分泌及巨噬細胞脂質的累積。多項研究表明，HDAC9基因多態性與冠心病、AS和缺血性卒中等密切相關[28-29]。本研究通過轉染特異性HDAC9 siRNA敲低LPS誘導的HCASMC中HDAC9的表達，結果顯示，敲低HDAC9能夠部分逆轉LPS誘導的HCASMC活力升高及凋亡下調。炎癥反應的激活能夠改變內皮細胞和VSMCs生物學行為，炎癥因子可以募集更多的炎性細胞以促進AS病變的形成[30-32]。本實驗結果顯示，敲低HDAC9基因

可抑制LPS誘導的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，降低LPS誘導的炎癥反應。提示HDAC9能夠通過抑制炎癥反應的激活抑制動脈粥樣硬化性心血管疾病的發生和進展，但其具體作用機制仍需深入探究。

綜上所述，敲低HDAC9基因能夠抑制LPS誘導的HCASMC增殖及炎癥反應，促進HCASMC凋亡。隨著對HDAC9基因研究的深入，相信其可能成為動脈粥樣硬化性心血管疾病治療新的分子靶向，但HDAC9在動脈粥樣硬化性心血管疾病中的作用機制目前尚不十分明確，有待進一步深入探究。此外，本實驗未在動物體內進行探究尚顯不足，后續實驗將對此補充和驗證。

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（本文編輯 于國藝）