皮膚扁平苔蘚組織miRNA-138及其靶蛋白表達

[摘要] 目的 探討miRNA-138（miR-138）及其相關靶蛋白細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P53在皮膚扁平苔蘚（LP）中的表達。方法 收集活檢切取的LP病人皮損組織標本40例（LP組），選取同期美容外科手術切除的正常皮膚組織標本35例作為對照組，采用RT-PCR法檢測兩組標本miR-138表達，ELISA法檢測Cyclin D1、P53蛋白表達。應用Spearman秩相關檢驗分析miR-138表達與Cyclin D1、P53表達之間的相關性。結果 與對照組比較，LP組Cyclin D1、P53蛋白表達明顯升高（t=-2.257、-2.217，Plt;0.05），miR-138表達下調（t=2.473，Plt;0.05）。Spearman秩相關分析顯示，LP皮損組織miR-138表達與Cyclin D1、P53呈負相關（r=-0.248、-0.264，Plt;0.05）。結論 miR-138可能在皮膚LP的發病機制中起重要作用。

[關鍵詞] 扁平苔蘚;微RNAs-138;細胞周期蛋白D1;基因，p53

[中圖分類號] R758.65 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-5532（2021）01-0133-03

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-138 （miR-138） and its related target proteins cyclin D1 and P53 in skin lichen planus （LP）. MethodsForty skin lesion tissue specimens were collected from biopsies in LP patients （LP group）， and 35 normal skin tissue specimens from cosmetic surgeries in the same period were collected as control group. RT-PCR was used to determine the expression of miR-138 in the two groups， and ELISA was used to determine the expression of cyclin D1 and P53 proteins. The Spearman rank correlation test was used to analyze the correlation of miR-138 expression with cyclin D1 and P53 expression. ResultsCompared with the control group， the LP group had significantly increased expression of cyclin D1 and P53 proteins （t=-2.257 and -2.217，Plt;0.05） and significantly down-regulated expression of miR-138 （t=2.473，Plt;0.05）. The Spearman rank correlation analysis showed that miR-138 expression in the skin lesion tissue of LP was negatively correlated with cyclin D1 and P53 （r=-0.248 and -0.264，Plt;0.05）. ConclusionmiR-138 may play a key role in the pathogenesis of skin LP.

[KEY WORDS]lichen planus; microRNA-138; cyclin D1; genes， p53

扁平苔蘚（LP）是一種病因不明的慢性炎癥性皮膚病，人群發病率低于1%[1]，主要累及皮膚和黏膜。其典型病理表現為基底細胞液化變性及真皮上部炎癥細胞浸潤帶[2]。MicroRNA（miRNA）不易被血清中核糖核酸酶降解，在血液和組織中穩定存在[3-4]，在炎癥、代謝和發育過程中發揮重要功能。miRNA-138（miR-138）是miRNA家族一員，有研究表明miR-138在口腔扁平苔蘚（OLP）中表達降低[5]。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p53是miR-138的靶基因。miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53是否在皮膚LP的發病機制中發揮作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53在皮膚LP病變組織中的表達及意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2018 年10月— 2020年3月，選取我院皮膚科收治的LP病人皮損組織標本40例（LP組），病人臨床表現典型并經組織病理學檢查確診為皮膚LP。選取同期我院美容外科手術切除的正常皮膚組織標本35例作為對照組。兩組均排除其他系統性疾病，均未使用糖皮質激素治療。

1.2 RT-PCR方法檢測miR-138的表達

使用Trizol（日本Takara公司）從皮膚組織樣本中分離出總RNA，第一鏈cDNA使用Mir-XTMmiRNAFirstStrandSynthesisandTBGreen試劑盒（Takara Bio USA， Inc）合成，實時PCR定量使用TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa）進行。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。miR-138引物（F：5′-AGCTGGTGTTGTGA-ATCAGGCCG-3′，R：5′-GTATCAACGCAGAGT-ACTTT-3′）、U6引物（F：5′-GGAACGATACAG-AGAAGATTAGC-3′，R：5′-TGGAACGCTTCAC-GAAATTGCG-3′）均由上海生工公司合成。

1.3 ELISA法檢測Cyclin D1、P53蛋白表達

應用Cyclin D1 ELISA試劑盒（江萊生物公司）、人腫瘤蛋白P53 ELISA試劑盒（Elabscience Biotechnology 公司）檢測標本Cyclin D1、P53蛋白含量，根據試劑盒說明書進行操作，同時設置空白對照孔。用酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度，繪制標準曲線，計算Cyclin D1、P53的表達水平。

1.4 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以±s形式表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組皮膚組織各指標檢測結果比較

與對照組相比，LP組miR-138表達降低，差異有顯著性（t=2.473，P<0.05）;CyclinD1、P53蛋白表達顯著升高，差異有顯著性（t=-2.257、-2.217，Plt;0.05）。見表1。

2.2 miR-138與Cyclin D1、P53表達的相關性

Spearman秩相關分析顯示，miR-138表達與Cyclin D1表達、P53表達均呈負相關（r=-0.248、-0.266，Plt;0.05）。見圖1、2。

3 討 論

LP是一種慢性炎癥性皮膚病，病程長，容易復發，常伴有瘙癢。其病因尚未明確，可能與遺傳、免疫、感染、精神因素等相關。既往關于miRNA與LP相關性研究主要集中在OLP，針對皮膚LP的研究相對較少。本研究主要檢測miR-138及其下游靶蛋白Cyclin D1、P53在皮膚LP中的表達，探討其在LP發病中的意義。

由于miRNA不易被血清核糖核酸酶降解，在血液和組織中能夠穩定存在，因此可用作臨床診斷和疾病監測的生物標志物。WANG等[6]研究顯示，miR-138表達水平升高可抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，并且降低MMP-2和MMP-9的表達。ZHOU等[7]的研究結果顯示，miR-138通過抑制MMP-2和MMP-9的表達降低了骨原性肉瘤細胞的侵襲。MMP-2、MMP-9是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，MMPs能夠降解細胞外基質的多種成分，在炎癥反應、組織愈合、組織重構以及腫瘤的侵襲與轉移等過程中發揮重要作用。研究顯示，MMPs與LP的發病有關[8-10]。另有研究發現，miR-138下調導致Th1/Th2失衡，參與了銀屑病的發病機制[12]。Th1/Th2平衡失調與LP發病密切相關[13]。本文研究結果顯示，皮膚LP組織中miR-138表達下調，推測miR-138異常表達與LP發病相關。

細胞增殖、分化與凋亡間的動態平衡與細胞周期的正常運行密切相關。對LP病變中細胞的增殖狀況以及細胞增殖與凋亡關系進行研究，將有助于揭示該病的發病機制。Cyclin D1是LP病變中與細胞增殖有關的基因，p53是LP病變中主要與細胞凋亡有關的基因。本文研究結果顯示，Cyclin D1、P53蛋白在皮膚LP中表達升高，推測Cyclin D1、 P53可能通過破壞角質形成細胞增殖與凋亡之間的平衡關系，促進細胞增殖，誘導細胞凋亡，進而在LP發病機制中發揮重要作用。

GHALLAB等[5]研究結果顯示，OLP病人標本中miR-138表達明顯下調，Cyclin D1基因和蛋白均過表達，二者表達呈負相關。雙熒光素酶報告基因實驗證實Cyclin D1是miR-138的靶基因[14]。Cyclin D1是細胞增殖過程中意義最大的細胞周期蛋白，在細胞周期控制中發揮重要調節作用[15]。既往有研究顯示，Cyclin D1可能參與OLP和LP的發病機制[16]。本文研究結果顯示，LP病人皮損組織中miR-138表達減少，Cyclin D1表達上調，二者呈負相關，差異有統計學意義。推測miR-138低表達通過調控其靶蛋白Cyclin D1誘導細胞增殖，可能在LP的發病機制中起著關鍵作用。

P53是參與細胞增殖和凋亡的眾多蛋白之一。雙熒光素酶報告基因實驗顯示p53是miR-138的靶基因。有研究發現，P53在OLP和LP中表達升高[17-18]。既往對細胞凋亡異常的研究主要集中在OLP，而對LP與凋亡的相關性研究相對較少。在細胞的正常發育過程中，由于P53半衰期短，所以蛋白水平較低;細胞在應激狀態下，其表達升高從而阻滯細胞周期和促進細胞凋亡。本文研究結果顯示，LP病人皮損組織中miR-138表達減少，P53表達上調，二者呈負相關，差異有統計學意義。推測miR-138表達下調會減弱對P53的抑制作用，從而誘導細胞凋亡，進一步證明miR-138的異常表達與LP發病相關。

綜上所述，miR-138表達降低可能通過調控Cyclin D1、p53基因表達，破壞角質形成細胞的增殖與凋亡之間的平衡關系，促進細胞增殖、誘導細胞凋亡，在LP的發病機制中發揮重要作用。

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（本文編輯 黃建鄉）