衰老對大鼠腦小動脈結構和收縮功能的影響

[摘要]"目的"探討衰老對大鼠腦小動脈結構和收縮功能的影響。方法"雄性SD大鼠30只隨機分為年輕組和老年組，每組各15只。年輕組大鼠飼養到15周齡、老年組大鼠飼養到65周齡時，取出腦組織，解剖并分離大腦中動脈M1段深入腦實質的小動脈，將其固定在Living system中，在模擬生理情況下，測量兩組腦小動脈內外徑隨壓力的變化情況，計算對應的血管結構參數并進行比較。結果"在有鈣情況下，老年組血管內徑和外徑均大于年輕組，差異有統計學意義（F=10.12、10.29，Plt;0.05）;老年組血管內徑變化百分比大于年輕組，差異有統計學意義（F=24.00，Plt;0.05）。在無鈣情況下，老年組血管內徑和外徑都大于年輕組，差異有統計學意義（F=7.83、17.85，Plt;0.05）;老年組血管內徑變化百分比小于年輕組，差異有統計學意義（F=39.50，Plt;0.05）。在結構參數方面，老年組血管的管壁厚度、血管壁橫截面積、管壁與管徑之比大于年輕組，差異有統計學意義（F=7.04～25.86，Plt;0.05）;老年組的管壁應變和應力小于年輕組，差異有統計學意義（F=40.02、7.05，Plt;0.05）;此外，老年組的血管硬化程度高于年輕組，差異有統計學意義（t=10.34，Plt;0.05）。結論"衰老不僅影響腦小動脈的收縮功能，從而影響腦實質局部血流調節，同時也在血管重塑和硬化中起著重要作用。

[關鍵詞]"衰老;彈性模量;血管硬化程度

[中圖分類號]"R743.1;R592

[文獻標志碼]"A

[文章編號]"2096-5532（2021）04-0487-06

我國已進入老齡化社會，到目前為止我國老齡人口接近3億，并以每年3%的速度遞增。隨著老齡人口增加，各種衰老相關疾病的發病人數也明顯增加，給社會和家庭帶來沉重的負擔。其中包括腦小血管相關的疾病，如腦出血、腦梗死以及認知障礙和癡呆等[1-2]。腦小血管包括腦小動脈、小靜脈和毛細血管，它們均在腦微循環中發揮著重要作用[3]，其中以腦小動脈的作用最為重要，因為腦小動脈與星形膠質細胞、神經元以及神經膠質細胞共同組成神經血管單位，從而控制和協調局部腦血流和阻力[4]。當腦小動脈結構和功能改變時，必然影響到腦實質的血流動力學參數，繼而導致血管內皮細胞損傷、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出以及神經損傷等。大量研究表明，衰老是多種重要生理功能減退的結果，同時也是諸多腦小血管相關疾病的危險因素，隨著衰老，腦小血管相關疾病的風險也相應增加[5]，但其發病機制仍然不是很清楚。本研究通過探討衰老對腦小動脈的結構和收縮功能影響，從而為衰老導致的腦小血管相關疾病發病機制的研究提供基礎。

1"材料與方法

1.1"實驗材料

雄性12周齡SD大鼠（體質量約345 g）30只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，隨機分為年輕組和老年組，每組15只，均飼養于SPF級動物實驗中心。實驗藥品包括NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、HEPES、NaH2PO4和葡萄糖，全部購自于美國Sigma公司。生理鹽溶液（PSS）內含：119.0 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、18.0 mmol/L NaHCO3、5.0 mmol/L HEPES、1.2 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L CaCl2、10.0 mmol/L葡萄糖、1.2 mmol/L NaH2PO4，使用前將pH值調整為7.4。

無鈣生理鹽溶液（PSS0Ca，除不含CaCl2以及增加0.03 mmo/L EDTA之外，其他成分和PSS相同），使用前也需將溶液pH值調整為7.4[6-7]。SZ2體視鏡、IMT-2倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;CH-1 Living system（美國Living systems公司，是一套可以模擬體內生理環境，保持離體血管活性和生理功能的裝置），由以下部分組成：可以固定血管的小水槽，壓力控制器（調節離體血管腔內的壓力），溫控裝置（維持離體血管溫度37 ℃左右），供氧系統（維持相對穩定的氧氣含量），圖像采集和顯示器（實時采集和放大血管圖像并對血管內外徑進行測量）。

1.2"實驗方法

1.2.1"動物模型制備"兩組大鼠均自由進食及飲水，避免刺激引起應激反應，人工照明控制晝夜節律各為12 h。年輕組大鼠飼養到15周齡、老年組大鼠飼養到65周齡時進行后續實驗。

1.2.2"麻醉及取腦"實驗前大鼠在安靜環境下休息60 min，稱質量后經腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉（50 mg/kg體質量）麻醉。待大鼠角膜反射和疼痛反射消失后斬頭，剪開頭頂皮膚，用咬骨鉗分離顱骨，取出大腦，置于冰上預冷的充滿PSS0Ca的玻璃皿中。

1.2.3"腦小動脈分離及其在Living system中的安裝和固定"在體視鏡下用小剪刀沿大腦中動脈（MCA）周圍剪開腦組織，取出一塊大小約4 mm×7 mm、包含MCA M1段（長度約為2.5 mm）的腦組織，置于另一充滿PSS0Ca的玻璃皿中。小心分離出MCA M1段深入腦實質的小動脈，將其轉移至Living system小水槽中，小水槽中充滿PSS[8-9]。用尖頭鑷子將腦小動脈一端套在小水槽的玻璃管上，再用6號外科縫線中的單根棉線將其固定，另一端固定在對側玻璃管上。將小水槽轉移到倒置顯微鏡下并通入混合氣體（其中含體積分數0.21的O2和0.06的CO2，0.73的N2），連接控溫裝置和加壓裝置，使水槽溫度維持在37 ℃，小動脈管腔內充滿PSS并將灌注壓維持在1.3 kPa。

1.2.4"圖像描記和血管內外徑測量"圖像采集系統采用高分辨率黑白相機，在顯示器上小動脈管壁因為透光性差而呈現灰黑色，管腔呈現灰白色，根據色差以兩側血管壁的灰黑色外邊界為基準測量血管外徑，以兩側血管壁黑色內邊界為基準測量血管內徑。在含鈣的情況下，待溫度上升到37 ℃時，按上述方法測量血管內徑和外徑初始值。等待25～30 min，使血管恢復活力并收縮穩定，依次升高灌注壓到1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa，每次升高灌注壓后維持3 min，測量有鈣情況下血管內徑和外徑值。有鈣情況下血管內徑測量結束后，將灌注壓降到0.7 kPa，以PSS0Ca置換小水槽中的PSS，反復洗滌6～8次直到血管不再收縮。待溫度恢復到37 ℃后，再次測量灌注壓分別為0.7、1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa時的血管內徑和外徑，為無鈣情況下血管內徑（ID0Ca）和外徑（OD0Ca）。

1.2.5"血管結構參數計算[10-14] 管壁厚度（μm）=（OD0Ca-ID0Ca）/2;橫截面積（μm2）=（π/4）×（OD0Ca-ID0Ca）;管壁厚度與管徑之比=管壁厚度/ID0Ca;管壁應力（σ）=（P×ID0Ca）/2×管壁厚度，式中的P為血管內灌注壓;管壁應變（ε）=（ID0Ca-ID0Ca 0.7 kPa）/ID0Ca 0.7 kPa。

血管硬化程度和剛度由彈性模量（E=σ/ε）來反映，彈性模量由應力-應變曲線來表示。應用Microsoft Office Excel軟件中最小二乘法對每一根血管對應的兩組數據（不同壓力下對應的系列血管應變值及系列血管應力值）進行指數曲線擬合，擬合模型σ=σ初始eβε，σ初始為壓力在0.7 kPa時初始內徑對應的σ值。擬合后每一根血管對應生成一條擬合曲線方程式，方程式中包含確切的σ初始值和β值，將σ初始值和β值的平均值代入擬合模型，并最終得到代表各組應力-應變的綜合方程式及對應曲線。擬合曲線中β值為對應曲線的斜率，反映彈性模量的大小，β值增加代表血管剛度和硬化程度增加[13-16]。

1.3"統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析，正態分布的計量資料以x2±s表示，兩組間比較采用t檢驗。采用雙因素方差分析比較組別和不同灌注壓及其交互作用對直徑的影響，應用Bonferroni進行兩兩比較。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2"結"果

2.1"腦小動脈內外徑隨灌注壓升高的變化

有鈣情況下，年輕組和老年組腦小動脈初始血管內徑分別為（25.50±4.20）、（25.67±3.60）μm，兩組間比較差異無統計學意義（t=1.79，Pgt;0.05）。灌注壓從1.3 kPa升高到8.0 kPa的過程中，血管表現為主動收縮，血管內徑組間比較差異有統計學意義（F組別=10.12，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=11.90，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=36.36，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時，老年組的血管內徑大于年輕組（t=3.89～5.06，Plt;0.05）。見圖1A和1B。血管外徑組間比較差異有顯著意義（F組別=10.29，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=6.81，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=17.99，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時，老年組的血管外徑大于年輕組（t=3.82～4.72，Plt;0.05）。見圖1C。血管內徑變化百分比組間比較差異亦有顯著意義（F組別=24.00，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=5.92，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=15.48，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在4.0～8.0 kPa時，老年組血管內徑增加百分比大于年輕組（t=5.08～7.11，Plt;0.05），隨著灌注壓升高，老年組血管持續擴張，而年輕組的血管先收縮，到6.7 kPa時才出現擴張。見圖1D。

在無鈣情況下，兩組在灌注壓從0.7 kPa升高到8.0 kPa的過程中，血管表現為被動擴張，血管內徑組間比較差異有統計學意義（F組別=7.83，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=176.60，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=14.45，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，在0.7、1.3、2.7 kPa時，老年組的血管內徑大于年輕組（t=3.23～3.86，Plt;0.05）。見圖1E。血管外徑組間比較差異有統計學意義（F組別=17.85，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=127.80，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=14.15，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時，老年組的血管外徑大于年輕組（t=3.04～5.16，Plt;0.05）。見圖1F。血管內徑變化百分比組間比較差異有統計學意義（F組別=39.50，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=158.20，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=29.91，Plt;0.05）;單獨效應分析結果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時，老年組血管內徑增加百分比小于年輕組（t=2.93～9.99，Plt;0.05）。見圖1G。

2.2"腦小動脈結構參數隨灌注壓升高的變化

血管壁厚度組間比較差異有顯著意義（F組別=7.04，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓=9.79，Plt;0.05），二者不存在交互作用（F交互=2.00，Pgt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時，老年組的血管壁厚度大于年輕組（t=2.78～2.90，Plt;0.05）。見圖2A。血管壁橫截面積組間比較差異有統計學意義（F組別=25.86，Plt;0.05），不同灌注壓相比較差異有統計學意義（F灌注壓=6.72，Plt;0.05），二者不存在交互作用（F交互=0.75，Pgt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時，老年組的管壁橫截面積大于年輕組（t=4.73～5.22，Plt;0.05）。見圖2B。血管壁厚度與管徑之比組間比較差異有顯著意義（F組別=7.23，Plt;0.05），不同灌注壓情況下比較差異有統計學意義（F灌注壓=43.99，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=3.742，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時，老年組管壁厚度與管徑之比大于年輕組（t=2.88～3.23，Plt;0.05）。見圖2C。

管壁應變組間比較差異有統計學意義（F組別=40.02，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異有統計學意義（F灌注壓 =156.10，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=29.54，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時，老年組管壁應變小于年輕組（t=2.96～9.95，Plt;0.05）。見圖2D。管壁應力組間比較差異有統計學意義（F組別=7.05，Plt;0.05），不同灌注壓比較差異具有統計學意義（F灌注壓=230.10，Plt;0.05），二者存在交互作用（F交互=10.60，Plt;0.05）;單獨效應結果顯示，灌注壓為6.7、8.0 kPa時，老年組管壁應力值均小于年輕組（t=4.45、5.34，Plt;0.05）。見圖2E。應力-應變曲線擬合模型：年輕組σ=1.31e5.44ε，老年組σ=1.05e9.95ε;曲線的擬合優度：年輕組R2=0.97，老年組R2=0.98;年輕組β=5.44±1.30，老年組β=9.95±1.31，老年組的β值大于年輕組（t=10.34，Plt;0.05）。見圖2F。

3"討"論

已有研究顯示，衰老會導致腦小動脈的肌源性反應一定程度的受損，肌源性反應是維持腦血流自調節的重要機制[17-18]。衰老后，腦小血管肌源性反應受損，可以導致腦血流自調節失常，繼而造成血管內皮細胞損傷、神經損害、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出等，并最終導致腦血管疾病、認知障礙和癡呆等[18-22]。衰老情況下，腦血管疾病發病率增高。

動脈重塑主要表現為動脈直徑、管壁結構、擴張性能以及硬化程度的變化。動脈重塑是動脈功能減退的主要標志[23]。本研究通過檢測在無鈣條件下血管被動擴張狀態的血管內徑、管壁厚度、橫截面積等以反映血管的重塑情況。在無鈣條件下，隨著灌注壓的升高，血管因為缺乏鈣而無法主動收縮，只能隨著灌注壓的升高而被動擴張。因此，在無鈣的情況下測量血管的各項指標可以反映血管的被動舒張性能。本文結果顯示，衰老情況下，血管內徑增大，管壁變厚，橫截面積增加，管壁厚度與管徑之比增大，擴張性能減弱，提示衰老會導致血管重塑、彈性變差，尤其是在血壓增高的情況下，更易發生腦血管意外。另外，衰老不是只影響腦的小動脈，很可能其他各器官小動脈都會受累，而小動脈系統具有容量血管和調節血流量的作用，當小動脈擴張性能減弱、彈性變差時，其容量血管和調節血流量的作用勢必受影響，這在一定程度上可能會影響外周阻力，從而促進高血壓的發生，但需要進一步的實驗去證實。

本文研究中腦小動脈的灌注壓范圍為1.3～8.0 kPa。已有多項研究證實，動脈灌注壓會隨著血管直徑的縮小而逐漸減小，腦表面動脈（直徑100～200 μm）的灌注壓大約為大動脈的50%以下[24]，即腦表面動脈的灌注壓為5.3～8.0 kPa，而腦小動脈的管徑則遠小于腦表面動脈，因此其正常灌注壓比5.3～8.0 kPa更小。已有研究顯示，衰老會導致小鼠腦小動脈的重塑[16]，但其使用的灌注壓為5.3～16.0 kPa，這遠超腦小動脈的正常灌注壓，并且也未比較收縮功能的差異，因此并不能真實反映腦小動脈的重塑情況以及自調節的改變。

另外，本文還引入了應力-應變曲線來描述血管的彈性性能和硬化程度。應力-應變曲線又稱為彈性模量，是衡量材料產生彈性形變難易程度的指標，其值越大，材料剛度越大，在一定應力下發生彈性形變的能力越小。本文結果顯示，對年輕組和老年組的應力和應變進行擬合后，計算得到老年組β值明顯大于年輕組，說明老年組的彈性模量明顯大于年輕組，因此老年組的腦小動脈具有更差的彈性性能和更高的硬化程度和剛度。進一步證實衰老會導致腦小動脈結構的改變。

綜上所述，衰老不僅會影響腦小動脈的收縮功能，從而影響腦實質局部血流量的調節，同時也在血管重塑和硬化中起著重要作用。腦小動脈的這些結構和功能的改變在腦小血管疾病的發病機制中具有重要意義。但是本實驗僅局限于體外實驗，腦血流的自調節不僅是動脈血管肌源性反應的結果，還受神經、體液等多種因素的影響，因此衰老對腦血流自調節的影響還需體內實驗加以驗證。

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（本文編輯"黃建鄉）