堿提法提取大球蓋菇多糖工藝 及其清除氧自由基研究

◎ 錢春強(qiáng)，林文飛，吳德平，劉南億

（1.宜興市好禧蟲草專業(yè)合作社，江蘇 宜興 214200；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食藥用菌研究所，浙江 杭州 310058）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata）又名皺環(huán)球蓋菇、赤松茸、大紅菇等，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富，口感細(xì)嫩的珍稀食用菌。大球蓋菇具有較強(qiáng)的抗雜和抗逆能力，適種季節(jié)廣，栽培過程中分泌的胞外纖維素酶可以很大程度上降解纖維素、木質(zhì)素，可以利用多種農(nóng)林廢棄資源[1-3]。其栽培模式多樣，栽培技術(shù)易于掌握，不需要復(fù)雜栽培設(shè)施，可以在林地和農(nóng)閑田進(jìn)行栽培[4]。栽培后的菌渣仍含有多種有機(jī)質(zhì)，可作為肥料直接還田[5]，有利于改良土壤結(jié)構(gòu)，增進(jìn)土壤肥力，促進(jìn)微生物活動(dòng)和作物根系發(fā)育，同時(shí)在一定程度上緩解農(nóng)林廢棄資源到處堆放而造成的環(huán)境問題，有利于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢物綜合利用，具有較好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。

大球蓋菇是我國(guó)20 世紀(jì)末從歐洲引進(jìn)的一種珍稀食用菇種，被世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）評(píng)為最值得向發(fā)展中國(guó)家推薦的“營(yíng)養(yǎng)、健康”菇種。大球蓋菇子實(shí)體中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、氨基酸及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，脂肪含量低，并含有牛磺酸、維生素C 等生物活性物質(zhì)[6]。其中，多糖是食用菌中的主要活性成分之一，種類豐富，活性和含量較高，可以提高生物體的免疫力，具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤等功效。大球蓋菇堿性多糖主要以半乳糖為主，還有甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖組成的雜多糖[7]。

本文對(duì)大球蓋菇堿性多糖的提取溫度、時(shí)間和堿液濃度3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，通過正交分析確定了其最佳提取工藝參數(shù)。本文通過過硫酸銨/N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（AP/TEMED）體系檢測(cè)大球蓋菇堿性多糖對(duì)氧自由基（O2-·）的清除率，對(duì)大球蓋菇堿性多糖的氧自由基清除作用進(jìn)行了初步研究，為大球蓋菇堿性多糖的生物活性研究提供了一定的數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大球蓋菇，購自江蘇宜興當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；氫氧化鈉、硫酸、重蒸苯酚、過硫酸銨（AP）、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、α－萘胺三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸（HCl）及冰醋酸，均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶，購自Sigma 公司；N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）。

透析袋（分子量6 000 ～14 000）、UV-3802 型紫外/可見分光光度計(jì)（北京高能科迪科技有限公司）、R201-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）、5430 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）以及真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康儀器公司）。

1.2 多糖提取方法

1.2.1 預(yù)處理

新鮮的大球蓋菇切片凍干后粉碎，置于真空干燥器內(nèi)儲(chǔ)藏。

1.2.2 水浴浸提

稱取適量大球蓋菇粉末置于燒杯中，根據(jù)需求按不同的水浴溫度、浸提時(shí)間、堿液濃度進(jìn)行熱水浸提，在浸提過程中使用電動(dòng)攪拌器對(duì)其進(jìn)行不停地?cái)嚢琛５玫浇嵋哼M(jìn)行抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以便下一步處理。

1.2.3 除蛋白

對(duì)上述多糖進(jìn)行脫蛋白處理，加入1%木瓜蛋白酶，60 ℃酶解4 h，再用Sevage法連續(xù)作用至溶液澄清，在波長(zhǎng)280 nm 處無蛋白吸收峰即可[8]。

1.2.4 醇沉

加入80%無水乙醇（v/v），靜置過夜后棄去上清液，收集沉淀，冷凍干燥后得到大球蓋菇堿性粗多糖樣品。

1.3 多糖得率測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL，不足1 mL 的用蒸餾水補(bǔ)至1 mL。然后加1 mL 的5%苯酚、5 mL 濃硫酸，靜置10 min。37℃水浴20 min 后在490 nm 測(cè)定吸光度A490。以蒸餾水做空白對(duì)照。

樣品測(cè)定：吸去1 mL 多糖待測(cè)液，按照上述方法測(cè)定A490。多糖得率由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得[9]。

1.4 單因素試驗(yàn)

以溫度（40℃、55℃、70 ℃、85 ℃和100 ℃）、時(shí)間（0.5 h、1.0 h、2.0 h、3 h 和4 h）、堿液濃度（0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1、0.020 mol·L-1、0.030 mol·L-1和0.040 mol·L-1）等3 個(gè)主要因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)來確定大球蓋菇堿性多糖的最佳提取參數(shù)。

1.5 正交試驗(yàn)

采用L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)上述單因素試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，并進(jìn)行方差分析確定該多糖提取的最佳工藝。試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素和水平表

1.5.1 大球蓋菇堿性多糖清除O2-·試驗(yàn)

過 硫 酸 銨/N，N，N′，N′- 四 甲 基 乙 二 胺（AP/TEMED）體系可以產(chǎn)生O2-·，而該O2-·能與羥胺溶液反應(yīng)生成NO2-，后者經(jīng)對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺顯色在波長(zhǎng)530 nm 處有特征吸收峰[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究大球蓋菇多糖對(duì)AP/TEMED 產(chǎn)生的O2-·的清除率來判斷其抗氧化活性。AP/TEMED 溶液的配制參照表2。

表2 AP/TEMED 體系溶液配制表[11-12]

在室溫條件下，吸取A 液0.4 mL，B 液1.6 mL于20 mL 具塞試管中混勻，反應(yīng)1 min；分別加入0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.8 mg·mL-1的大球蓋菇堿性多糖溶液1 mL、10 mmol·L-1的鹽酸羥胺0.4 mL，振蕩混勻，靜置反應(yīng)20 min；加 入17 mmol·L-1對(duì) 氨 基 苯 磺 酸2 mL 和7 mmol·L-1α-萘胺2 mL，震蕩混勻，并反應(yīng)25 min。用等體積的正丁醇對(duì)顯色液進(jìn)行萃取，4 000 r·min-1離心15 min，在530 nm 處測(cè)定有機(jī)相吸光度值。按式（1）計(jì)算O2-·清除率。

式（1）中，A-對(duì)照液的A530值；B-待測(cè)液的A530值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1 可知，當(dāng)提取溫度為85 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高值，為6.29%，其中多糖得率隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，這是由于溫度過高會(huì)引起多糖糖苷鍵斷裂，多糖降解。

圖1 提取溫度對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

由圖2 可知，提取時(shí)間從0.5 h 提高到1.0 h，多糖得率增幅極大，當(dāng)時(shí)間增加至2 h 時(shí)，多糖得率達(dá)到最高點(diǎn)，為6.21%。

圖2 提取時(shí)間對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

由圖3 可知，隨堿液濃度提高，多糖得率先增加后減小，并在堿液濃度為0.02 mol·L-1時(shí)，多糖得率達(dá)到峰值。

圖3 堿液濃度對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

2.2 多糖工藝的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定以下3 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，其分析結(jié)果參見表3。

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析可知，影響大球蓋菇堿性多糖得率的諸因素大小順序是：溫度（A）>堿液濃度（B）>時(shí)間（C），最佳組合為A2B3C3，即提取溫度為85 ℃，堿液濃度為0.03 mol·L-1，提取時(shí)間為2 h。在此條件下，大球蓋菇堿性多糖得率為6.98%。

2.3 正交試驗(yàn)的方差分析

為判斷上述3 因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是否存在，將正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，找出其中起主導(dǎo)作用的變異來源，其結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析表

由表4 可知，3 個(gè)因素中提取溫度對(duì)多糖得率具有極顯著性影響（P<0.05），提取時(shí)間和堿液濃度的影響均不顯著（P>0.1），其中，對(duì)多糖得率的影響最不顯著的是提取時(shí)間，這與正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

2.4 大球蓋菇堿性多糖對(duì)O2-·的清除作用

由表5 可知，大球蓋菇堿性多糖對(duì)O2-·的清除作用呈濃度依賴性，在多糖濃度為0.8 mg·mL-1時(shí)，其清除率達(dá)到80.12%。因此，可以看出大球蓋菇堿性多糖具有較好的O2-·清除作用，這和地鱉蟲多糖相似[13]。

表5 多糖對(duì)O2-·的清除率表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及方差分析，確定了大球蓋菇堿性多糖的最佳工藝條件：浸提溫度85 ℃，堿液濃度0.03 mol·L-1，提取時(shí)間2 h，在此工藝條件下，多糖得率達(dá)到6.98%。方差分析表明，浸提溫度是影響大球蓋菇堿性多糖得率的主要因素，而提取時(shí)間和堿液濃度的影響較小。對(duì)最佳工藝條件下提取的大球蓋菇堿性多糖進(jìn)行O2-·清除能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有較好的O2-·清除作用，也即具有較好的抗氧化能力，至于其清除DPPH 和·OH 自由基的能力還有待進(jìn)一步研究。本研究為大球蓋菇的生物活性研究及產(chǎn)學(xué)研一體化奠定了基礎(chǔ)。