γ-神經突觸核蛋白在電針改善大腦中動脈閉塞模型大鼠認知功能中的作用*

徐芳媛 ，羅來 ，許金森 ，潘曉華 ，黃倩茹 ，萬隆 ，朱佳敏

1 福建中醫藥大學針灸學院 福建福州 350108

2 福建省中醫藥科學院 福建福州 350003

3 福建省經絡感傳重點實驗室 福建福州 350003

腦卒中是神經系統中最為常見和多發的疾病，而在腦卒中患者中，發病3個月內的大多以肢體功能障礙為主要表現[1]，因此對患者的的日常生活和生存質量造成了巨大的影響。針灸治療腦卒中的水平已經日趨成熟，電針已經成為針灸臨床中廣泛應用的醫療器材[2]。運用電針治療是腦卒中的一個重要治療手段，在既往的研究中也取得了良好的效果[3]。γ-神經突觸核蛋白（SNCG）主要分布在大腦的突觸前末端和周圍神經系統，它是具有高保守性和低分子量的可溶性蛋白[4]。SNCG在胚胎和新生兒腦組織中不表達，但會隨著年齡的增長而不斷增加，而三叉神經節在胚胎發育的10～11d后終止并逐漸成熟[5]。在神經系統中，它可能參與突觸功能和可塑性的調節，并且與神經生長和神經網絡的穩定性有關[6]。因此，本研究通過觀察電針對大腦中動脈閉塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的腦卒中癥狀的影響，和缺血側海馬中SNCG 蛋白含量變化來探討電針治療腦卒中的機制，為電針治療腦卒中提供理論依據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用成年的SD雄性大鼠共18只，均由福建醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，體質量（300±20）g，大鼠等級：清潔級。每籠6只大鼠，均自由進食及飲水，適應性飼養1周。飼養條件：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12h明暗交替，自由進食與飲水。實驗過程中均嚴格按照國際動物保護及使用指南的規定進行。

1.2 主要實驗器械與試劑 華佗牌30號0.5寸不銹鋼毫針（中國上海） 、SDZ-II型華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）、小動物呼吸麻醉系統（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800號大鼠用MCAO線栓（廣州佳靈生物技術有限公司）、潔凈工作臺（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）、ViiA 7 Realtime PCR System 熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）、酶標儀（Thermo）、2X PCR master mix試劑盒（Arraystar）、Primer試劑盒（英駿生物技術有限公司）、細胞及組織總蛋白抽提試劑盒（KangChen，KC-415）、BCA 蛋白質定量試劑盒（KangChen，KC-430）。

2 分組與造模

將18只大鼠按隨機數字表法隨機均分為電針組、模型組、假手術組。電針組和模型組參考Longa改良線栓法[7]，在大鼠左側行MCAO手術，具體操作方法為[8]：①大鼠術前禁食不禁水12 h；②將大鼠投入透明麻醉誘導盒中，開啟異氟烷流量并調至500 ml/min，濃度調至5 %，持續1min，待大鼠呼吸平穩緩慢，縮爪反射消失后，將大鼠取出戴上呼吸面罩，并根據術中大鼠對手術刺激的反應，適當調節濃度、流量以維持麻醉深度；③將麻醉后大鼠四肢固定仰臥于手術板上，剔除左側頸部毛發，用酒精對暴露皮膚進行消毒，于頸部前正中線切開皮膚，鈍性分離左側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）；④使用縫合線在左側ECA的遠心端打一個死結，結扎ECA，繼而使用動脈夾夾閉ICA、ECA的遠心端；雙極電凝器電凝ECA的1個分支，避免在剪斷時失血；在ECA距CCA的分叉1 cm處剪開1個小口，將線栓緩慢沿ECA插入ICA，在剪口處向下約2 mm處使用縫合線打一活結略微綁緊ECA，之后剪斷ECA并將殘端反折以使線栓插入ICA，遇到輕微阻力時即停止插入，進線深度為18～22 mm，再將ECA殘端的活結打死防止線栓脫出；⑤縫和傷口并消毒，2 h后輕柔回抽線栓至CCA分叉處，減去線栓的體外部分，實現再灌注損傷；⑥假手術組只將頸部皮膚剪開，鈍性分離CCA、ICA、ECA后即縫合，不予結扎和插線；⑦保持室溫為25℃左右，直至大鼠蘇醒。

3 動物造模后篩選

再灌注 2h，大鼠完全蘇醒后，對所有大鼠進行提尾實驗[9]。將大鼠尾巴提起后，右前肢屈曲，表明造模成功，進入下一階段實驗；若大鼠能夠正常活動、進食，或不能自發行走意識朦朧或喪失則為造模失敗，退出實驗。

4 干預措施

電針組參考《實驗針灸學》[10]選取大鼠“神庭”“百會”穴，選用華佗牌30號0.5寸不銹鋼毫針沿頭部向上斜刺0.2～0.3 cm，連接SDZ-II電針儀，以針體輕微抖動且大鼠耐受為度，選取疏密波，頻率為2～10 Hz，每次干預時間為20 min，于大鼠術后24 h開始進行干預，連續7日。模型組和假手術組行同等條件抓取后回籠，不予治療。

5 標本采集與檢測

5.1 平衡木實驗 在手術后第1，3，7天對3組大鼠進行平衡木實驗，判斷神經損傷情況[11]。將大鼠放置在1根寬1.5cm、長30cm、高于地面30cm的木條上，觀察它們的行為表現。實驗前1周對各組大鼠進行訓練：每日8點和17點各訓練1次，每次10 min，以大鼠能順利在平橫木上保持穩定為標準。造模成功后分別在第1，3，7天對每組大鼠進行平衡木實驗并評分[12]，評分為0～6分，0分：大鼠在平衡木上能夠保持平衡穩定；1分：大鼠在平衡木上需要抓緊平衡木邊緣才能保持平衡穩定；2分：大鼠需抓緊平衡木但是同時有一只腳落下才能保持平衡穩定；3分：大鼠需要抓緊平衡木但是同時有兩只腳落下，或在平衡木上旋轉，能夠堅持在平衡木上的時間≥60s；4分：大鼠試圖在平衡木上保持平衡，但落下，同時能夠堅持在平衡木上的時間≥40s；5分：大鼠試圖在平衡木上保持平衡，但落下，同時能夠堅持在平衡木上的時間≥20s；6分：落下，沒有試圖保持平衡或抓住平衡木，能夠堅持在平衡木上的時間≤20s。評分越高神經損傷越嚴重。

5.2 q-PCR檢測腦組織SNCG mRNA表達 實驗結束后，取出大鼠左側海馬，放入RNA的保存液中，繼而放入-80 ℃冰箱里面備用。參照Trizol一步法說明提取總RNA[13]，具體步驟為：①每50～100mg組織樣品，加入1ml的Trizol試劑，用電動勻漿器進行勻漿；②每1ml的Trizol試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，離心15min；③離心后將水相轉移到新離心管中，水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻沉淀后于離心10min；④移去上清液，加入75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，離心5min；⑤去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5～10min；⑥溶解RNA，獲得的RNA溶液保存于-70°C；⑦配制退火混合物；⑧短暫離心后，在離心管中依次加入RT反應液；⑨移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，50℃溫育60min，70℃ 溫育15min使酶失活，cDNA置冰浴待用或-20℃保存。引物序列見表1。q-PCR反應體系：反應總體積10 μL，其中上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，qPCRmaster-Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反應條件：95℃，10min；40個PCR循環（95℃，10秒；60℃，60秒（收集熒光））。每個標本均設復孔，重復3次，獲得SNCG mRNA基因Ct值，以GAPDH為內參，按照2-△△Ct方法處理數據。其中，△Ct=（目的基因平均Ct-內參平均Ct）；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct），所有數據均與內參比較。

5.3 免疫蛋白印記（WB）檢測腦組織中SNCG的蛋白的表達 制備蛋白樣品[14]，具體步驟為：①將細胞提前種植在6cm平皿中，待細胞長至70%～80%時取用，加入2mlPBS洗滌2遍，徹底吸凈PBS殘液；②加入細胞裂解液 150μl，將細胞刮下，放在冰上裂解20min，然后將裂解液移至EP管中，離心20min；③將上清液移入新的EP管中，即為所需蛋白樣品；④運用 Bradford 法測定蛋白樣品的濃度；⑤向其余蛋白樣品中加入其1/4體積的5X上樣緩沖液，混勻，煮沸10min，存于-20℃待用。蛋白質電泳的具體步驟為：①配膠：配制8%的下層膠和6%的上層膠；②上樣電泳：每個蛋白泳道上樣量10μl，電泳時間為45min，恒定電流25m；③轉膜：電泳完成后將蛋白質轉移到NC膜上，轉膜時間為45min，電壓恒定20V；④立春紅染色證實轉膜情況，標記標準蛋白分子量所在位置，去離子水洗 2 遍；⑤PBST 配制的 5%的脫脂牛奶室溫封閉1h；⑥PBST 配制 2.5%脫脂牛奶稀釋一抗（1：500）封閉條帶置于搖床，4℃冰箱過夜；⑦PBST洗3min×5次；⑧PBST 配制 2.5%脫脂牛奶稀釋辣根酶標記的二抗（1：2000），室溫封閉 1h，PBST 洗 3min×5次；⑨ ECL 顯影。

6 數據處理

結 果

1 平衡木實驗評分

造模手術24 h后，電針組的平衡木實驗評分高于假手術組（P=0.002），模型組的平衡木實驗評分高于假手術組（P=0.002），電針組和模型組之間無明顯差異（P＞0.05）；術后3d電針組評分和假手術組存在差異（P=0.009），但電針組低于模型組評分（P=0.009），模型組評分高于假手術組（P=0.001）；術后7 d后電針組評分高于假手術組，兩者之間存在差異（P=0.035），電針組明顯低于模型組（P=0.003），模型組評分高于假手術組（P=0.001），3組之間存在明顯差異，見表2。

表1 引物序列

表2 3組大鼠神經功能缺損評分比較（）

表2 3組大鼠神經功能缺損評分比較（）

組別 例數 術后1d 術后3d 術后7d電針組 6 5.11±0.54 3.23±0.51 2.23±0.42模型組 6 5.23±0.69 5.89±0.76 5.92±0.02假手術組 6 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00

2 SNCG在海馬中的表達

電針組較假手術組而言，SNCG mRNA表達量明顯升高（P=0.027）；模型組較假手術組而言，SNCG mRNA表達量明顯降低（P=0.023），電針組和模型組之間存在明顯差異（P=0.004），見表3。

表3 3組大鼠海馬中SNCG mRNA的表達（）

表3 3組大鼠海馬中SNCG mRNA的表達（）

組別 只數 SNCG mRNA電針組 6 0.05±0.003模型組 6 0.01±0.009假手術組 6 0.03±0.003

3 Western blot 檢測 SNCG在腦組織中蛋白的表達

電針組較假手術組而言，SNCG 蛋白的表達量無明顯差異（P=0.213）；模型組較假手術組而言，SNCG蛋白的表達量明顯降低（P=0.002），電針組和模型組之間存在明顯差異（P=0.007），見表4。

表4 3組大鼠海馬中SNCG 蛋白的表達（）

表4 3組大鼠海馬中SNCG 蛋白的表達（）

組別 只數 SNCG mRNA電針組 6 0.90±0.005模型組 6 0.71±0.008假手術組 6 0.96±0.009

討 論

運動功能障礙是腦卒中的主要并發癥，腦卒中患者出現運動障礙以及神經障礙等癥狀的概率為80%[15]。腦卒中對患者的正常生活與工作均造成不同程度的影響，并且在疾病不斷的發展過程中，導致患者出現偏癱的病癥，甚至導致患者的死亡[16]，因此，腦卒中疾病的危險性與死亡率較高。

平衡木實驗是較為經典的檢測神經功能缺損的指標，可以直觀的反應大鼠大腦與肢體當前的協調配合控制能力[17]。本研究結果顯示，對腦卒中大鼠進行電針“神庭”“百會”6周的治療后，其平衡木實驗評分較模型組有明顯的改善，并且3組之間存在統計學差異，可以認為電針神庭、百會對于MCAO大鼠的神經功能缺損有明顯的改善作用。

近年來，功能基因組學技術已經廣泛運用于動植物生理生化、腫瘤與干細胞、腦及中醫藥研究等領域，并促進了相關領域的發展[18-19]。全轉錄組測序和蛋白組測序分析結果顯示，SNCG mRNA及其編碼的神經核蛋白-γ在假手術組中均為低表達，在模型組顯著上調，電針顯著抑制其高表達量，SNCG mRNA及其編碼的神經核蛋白-γ在3組動物中的表達趨勢一致，表現為在轉錄水平的有效調節[20]。

通過比較3組大鼠海馬中SNCG mRNA的表達量，可以發現電針組較假手術組有明顯的升高，而模型組較假手術組有明顯的降低。研究發現MCAO大鼠海馬中SNCG的表達量比假手術組要低，而通過電針治療后，SNCG會明顯的升高，可以認為SNCG與大鼠認知功能之間存在關系。

通過比較3組大鼠海馬中SNCG 蛋白的表達量，可以發現電針組較模型組有明顯上升，模型組較假手術組有明顯的降低。研究表明MCAO大鼠海馬中SNCG蛋白的表達量比假手術組要低，而通過電針治療后，SNCG的蛋白表達會明顯的升高，可以認為SNCG蛋白表達量與大鼠的認知功能之間存在聯系。

在既往的研究中，已經有大量實驗論證了SNCG對腫瘤細胞之間存在關聯性，卻極少文章有提到與腦卒中的聯系[21]。SNCG在胚胎和新生兒腦組織中不表達，但會隨著年齡的增長而不斷增加，而隨著它的增長，我們的腦功能不斷健全完善，使我們從嬰幼兒成長為腦功能健全的成年人，而隨著年齡的增加，SNCG在不斷的減少，導致腦卒中在中老年群體中發病最明顯。在本次實驗中，經過電針干預后，電針組大鼠海馬中SNCG mRNA的表達較假手術組明顯升高，模型組大鼠海馬中SNCG mRNA的表達較假手術組明顯降低。結合本實驗大鼠神經功能評分結果，我們認為造模后大鼠海馬組織中SNCG mRNA的表達降低通過某種途徑促使神經功能評分升高，電針干預后促進了SNCG mRNA的表達，增加了SNCG的釋放，降低神經功能評價，達到治療的目的，因此SNCG可能是治療血管性認知障礙的潛在靶點之一。經過電針干預后，電針組大鼠海馬中SNCG對比的表達較模型組明顯升高，模型組大鼠海馬中SNCG 蛋白的表達較假手術組明顯降低。進一步論證了電針能有效提高SNCG蛋白的表達，深入明確了SNCG與血管性認知障礙之間的聯系，但由于腦卒中病理機制的復雜性和電針干預效果的多靶點特征，對于電針改善腦卒中癥狀的機制還有待進一步研究。