上調miR-126對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用及機制

尚 娟,祝 瑞

(川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院重癥醫學科,南充 637000;*通訊作者,E-mail:shangjuanzzyx@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是呼吸系統最常見的急危重癥之一,以肺組織過度炎癥反應和微循環通透性增加為主要特征,已經成為重癥醫學科患者死亡的主要原因之一[1]。ALI的病因多樣,發病機制復雜,但炎性反應失控在ALI發病過程中的作用已經得到公認[2]。目前臨床上對于ALI的治療以對癥支持治療為主,仍缺乏特異性藥物和有效的治療手段,死亡率仍居高不下[3]。因此探索能夠抑制ALI早期過度和失控炎癥反應的有效手段意義重大。

微小RNA(miRNAs)是由19-25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA,通過調控下游靶基因的表達發揮作用,參與調控機體細胞許多重要的生命活動[4]。近年來研究顯示miRNA在機體炎癥反應的調控中發揮著重要的作用,并且與ALI的發生進展密切相關[5]。研究發現miR-126是血管和心臟、肺等組織器官的內皮細胞中高表達的miRNA之一,參與多種免疫細胞的發育和功能的調控[6,7],在機體炎癥方面起著重要的作用[8-10]。Huang等[11]通過基因芯片技術發現包括miR-126在內的多個miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達降低,然而具體作用機制尚不清楚。因此,本研究通過體外構建膿毒癥ALI小鼠模型,探索miR-126對小鼠ALI肺損傷的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

清潔級C57BL/6小鼠40只,雄性,8-10周齡,體質量20-25 g,購自川北醫學院實驗動物中心。LPS購自美國Sigma公司;agomiR-NC、agomiR-126購自上海吉瑪公司;髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成公司;IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;PCR引物購自廣州銳博生物公司;HMGB1、GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 小鼠分組及ALI模型建立

40只C57BL/6小鼠隨機分為control組、ALI組、ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組,每組10只。ALI組利用腹腔注射LPS(5 mg/kg)誘導建立ALI模型[12,13],ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組在建立ALI模型后即刻,分別從尾靜脈給予注射agomiR-NC和agomiR-126(80 mg/kg),control組僅以等量的生理鹽水進行腹腔和尾靜脈注射。本研究經實驗動物倫理委員會審查批準(批文號20190105),整個實驗過程嚴格遵循《實驗動物管理條例》規定。

1.3 觀察指標

1.3.1 血氣分析 ALI模型建立后24 h,用含肝素鈉注射器經頸動脈采血0.5 ml,在全自動血氣分析儀上行動脈動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值的檢測。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的檢測 ALI模型建立后24 h,頸椎脫臼法處死小鼠,開胸,結扎氣管和右側主支氣管,用1 ml注射器穿刺進入左側主支氣管應用0.3 ml PBS緩慢進行肺泡灌洗3次,收集BALF,4 ℃離心取上清液,應用IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度。

1.3.3 肺組織病理學觀察及肺損傷評分 取小鼠右肺上葉組織,4%多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋,行5 μm切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織的病理學變化,并參考文獻[14]的方法進行肺損傷病理評分。肺損傷病理評分依據肺泡出血、肺泡間隔水腫、肺泡內中性粒細胞浸潤、肺泡內纖維蛋白沉積4個方面進行評價,根據病變程度分別賦分:0分,正常或者輕微病變;1分,輕度病變;2分,中度病變;3分,重度病變。

1.3.4 肺濕重/干重(W/D)比值的檢測 取右肺中葉及下葉組織100 mg,濾紙沾干表面水分,天平稱濕重后,放入80 ℃恒溫烘箱中烘烤48 h后,天平稱干重,計算W/D比值。

1.3.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 取右肺中葉及下葉組織100 mg,液氮研磨后,RIPA裂解液冰上裂解,收集裂解液,4 ℃離心取上清液,采用MPO檢測試劑盒測定MPO活性。

1.3.6 肺組織中miR-126表達的檢測 采用qRT-PCR測定肺組織miR-126的表達。取右肺中葉及下葉組織,應用Trizol提取肺組織總RNA,應用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。參照qRT-PCR試劑盒說明書反應體系進行qPCR反應。miR-126引物正向:5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′,反向:5′-CAUUAUUACUCACGGUACGAUU-3′;U6引物正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,進行45個循環。以U6作為內參,miR-126的表達采用2-ΔΔCt法計算。

1.3.7 肺組織中HMGB1蛋白表達的檢測 采用Western blot法測定肺組織HMGB1蛋白的表達。取右肺中葉及下葉組織勻漿,加入RIPA裂解液提取蛋白并蛋白定量。取50 μg蛋白上樣,行10% SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉3 h,加入抗HMGB1(1 ∶1 000)和GAPDH一抗(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜,次日再加入二抗室溫孵育1 h,經曝光顯影、照相,圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達水平的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺組織miR-126相對表達明顯降低(P<0.05),HMGB1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織miR-126和HMGB1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織miR-126表達明顯升高(P<0.05),HMGB1蛋白表達明顯降低(P<0.05,見表1,圖1)。

表1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達水平的比較

圖1 各組小鼠肺組織HMGB1蛋白表達Figure 1 Expression of HMGB1 protein in lung tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠動脈血氣分析結果比較

與control組比較,ALI組小鼠動脈血pH值和PaO2明顯降低(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠動脈血pH值和PaO2差異無統計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠動脈血pH值和PaO2明顯升高(P<0.05)。各組小鼠動脈血PaCO2明顯差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組小鼠血氣分析結果比較

2.3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的比較

與control組比較,ALI組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量差異無統計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少(P<0.05,見表3)。

表3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度的比較

2.4 各組小鼠肺組織病理學改變及肺損傷評分比較

control組小鼠肺泡形態規則,結構清晰完整。與control組比較,ALI組小鼠肺泡結構雜亂,肺泡壁增厚,肺泡腔內可見大量炎性細胞及紅細胞,肺損傷病理評分明顯升高(P<0.05,見圖2、表4);與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織病理學改變相近,肺損傷病理評分差異無統計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織病變學改變明顯減輕,肺損傷評分明顯降低(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組小鼠肺組織的病理學改變 (HE染色,×200)Figure 2 Pathological changes of lung tissue in mice in each group (HE staining,×200)

表4 各組小鼠肺組織損傷評分、W/D比值、MPO活性的比較

2.5 各組小鼠肺W/D比值、MPO活性的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺W/D比值、MPO活性差異無統計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯降低(P<0.05,見表4)。

3 討論

膿毒癥是急性肺損傷發病的最常見原因之一,能夠直接或間接引起不同程度的肺損傷,嚴重者進展為ARDS,病死率可高達60%[15]。過度炎癥反應是膿毒癥誘發ALI的重要原因,但具體分子機制尚不清楚,如何有效控制ALI過程中過度炎癥反應,對于ALI的治療至關重要[16]。LPS是內毒素的主要成分,進入機體后快速誘發“炎癥風暴”,導致彌漫性肺損傷,腹腔注射LPS制備ALI動物模型是目前常用的理想方法[17,18]。本研究發現,ALI模型制備24 h后,小鼠動脈血pH值和PaO2明顯降低,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多,肺組織出現ALI典型的病理學改變,肺損傷評分、W/D比值、MPO活性明顯升高,提示本研究制備ALI模型成功。

近年來研究顯示miRNA在ALI的發生發展中發揮重要的調控作用。Li等[19]在研究中發現miR-33低表達參與了LPS誘導的ALI的發病機制。過表達miR-146b可以有效地抑制LPS誘導的ALI小鼠的炎癥反應,減輕肺組織損傷[20]。miR-16通過調節TLR4/NF-κB通路和減輕炎癥反應,對小鼠ALI具有顯著的保護作用[21]。Wang等[22]發現miR-19缺陷的小鼠肺組織更容易受到炎癥反應的影響,恢復miR-19能夠減輕LPS誘導的ALI的炎癥反應。研究發現miR-126與機體多種疾病的炎癥及免疫反應有關[23,24],近期基因芯片技術發現包括miR-126在內的多個miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達降低[11],miR-126在ALI肺組織中表達降低是否與炎癥反應有關尚不清楚。本研究中我們通過qRT-PCR也發現ALI組小鼠肺組織miR-126表達明顯降低。進一步我們通過對ALI小鼠尾靜脈注射miR-126模擬物成功上調ALI小鼠肺組織中miR-126的表達,結果顯示,小鼠動脈血氣分析明顯改善,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少,肺組織病理學改變明顯減輕,肺損傷評分、W/D比值、MPO活性明顯降低,提示上調miR-126能夠抑制ALI的炎癥反應,改善小鼠的肺組織損傷。

近期研究發現,miR-126能夠通過靶向調控HMGB1抑制高糖環境下內皮細胞[25]和視網膜細胞[26]的炎癥反應。本研究中我們也發現ALI小鼠肺組織中HMGB1蛋白的表達明顯升高。為了探索miR-126對ALI炎癥反應的抑制作用是否與其對HMGB1的調控有關,我們發現上調miR-126表達后,ALI小鼠肺組織HMGB1蛋白的表達明顯降低,提示上調miR-126對ALI小鼠肺組織的炎癥反應的抑制作用可能與其對HMGB1的調控有關。HMGB1是一種進化上高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白,已經被證實在致死性的系統性炎癥反應中發揮著調節炎性介質的作用。HMGBl刺激促炎細胞因子的釋放,反之,促炎細胞因子也能促進HMGBl的釋放[27],形成了一個能夠放大炎癥反應的正反饋環。Abraham等[28]發現直接在小鼠氣管內注射HMGB1后會出現中性粒細胞聚集,肺水腫及IL-1β、TNF-α和MIP-2分泌的增加。研究發現,在內毒素引起的ALI中,HMGB1激活NF-κB轉錄引起的炎性因子水平的增加,導致肺血管滲透性的增加[29,30],從而引起ARDS。特異性阻斷HMGB1可明顯減輕LPS引起的損傷,Gong等[31]證實了HMGB1拮抗劑通過減少促炎因子的產生,對LPS導致的ALI小鼠有顯著保護作用。

綜上所述,miR-126在ALI小鼠肺組織中呈現異常低表達,上調miR-126能夠減輕ALI小鼠肺組織的炎癥反應,其機制可能與其對HMGB1的抑制有關,為ALI的治療提供了新的研究方向。