miR-20a靶向TLR4通路對巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染作用的影響

王 玲,孟偉民

(1青海省第四人民醫院呼吸五科,西寧 810000;2青海省第四人民醫院重癥醫學科)

結核病是人類三大傳染性疾病之一,結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)是引起結核病的病原菌,可侵犯全身各器官,以肺結核最為常見[1]。巨噬細胞是人體免疫細胞,是Mtb侵入機體的主要靶細胞,在Mtb感染宿主時,其可以通過吞噬作用、自噬、凋亡等機制對細胞內Mtb進行清除[2]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)在免疫反應和免疫逃逸中有重要作用,廣泛分布于人體各種細胞表面[3]。機體在感染Mtb之后,巨噬細胞和樹突細胞上的TLRs能夠特異性識別Mtb上的病原體相關模式分子(pathogen associated molecular pattern,PAMP),促進細胞因子的合成與釋放,誘導機體產生獲得性免疫反應[4]。TLR4能夠通過激活髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 8,MyD88)依賴性通路和MyD88非依賴通路在Mtb感染巨噬細胞中發揮作用[5]。miRNA與細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡等過程有關,多個研究表明miRNA通過調控TLR4通路調節巨噬細胞抗Mtb感染過程[6-8]。TLR4是miR-20a的一個下游靶基因[9],對miR-20a靶向調節TLR4信號通路在巨噬細胞抗Mtb感染的作用還不清楚。因此本研究通過檢測巨噬細胞感染Mtb后miR-20a的表達,分析miR-20a靶向TLR4通路在巨噬細胞抗Mtb過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

THP-1人單核細胞株(SCSP-567),購自于中國科學院細胞庫;H37Ra Mtb菌種,購自于美國BD公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(貨號:P8139)購自于美國Sigma公司;Lipofectamine 3000試劑盒(貨號:L3000008),購自美國Invitrogen公司;RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(貨號:9108Q、RR037、RR820Q),購自日本TAKARA公司;胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI-1640培養基、消化胰酶(貨號:10099,15070063,61870036,25200056)購自美國Gibco公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:KFS303),購自北京百奧萊博科技有限公司;Bcl-2、Bim、TLR4、MyD88、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、p-MAPK、β-actin單抗(貨號:4223,2933,14358,4283,4696,4370,8457),購自美國Cell Signaling Technology公司;Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡雙染試劑盒、辣根過氧化物酶標記二抗、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(貨號:A0208、P0033、P0012、C1062),購自南通碧云天生物技術公司;mi20a、U6、miR-20a mimics、miR-20a mimics-negative control,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀,購自美國ABI公司;Nanodrop 2000、酶標儀、蛋白凝膠成像儀,購自美國Thermo Fisher公司;流式細胞儀,購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人源性單核細胞株THP-1培養 取1 ml凍存THP-1細胞37 ℃水浴中快速解凍,轉移至離心管中,并加入9 ml RPMI-1640培養基,吸打混勻,1 000 r/min離心5 min,棄上清,轉移至含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中,37 ℃、5%CO2培養箱中培養傳代。

1.2.2 THP-1源性巨噬細胞培養 將1.2.1中對數期細胞接種至6孔板中,并調節細胞濃度為6×105個/孔,100 ng/ml PMA處理THP-1單核細胞24 h,37 ℃、5%CO2培養箱中培養,細胞形態由單個圓形懸浮細胞轉變為貼壁、形態不規則的貼壁細胞,THP-1單核細胞分化為巨噬細胞THP-1。

1.2.3 Mtb感染巨噬細胞THP-1 感染前1 d,將1.2.2中巨噬細胞THP-1接種至24孔板,調整細胞濃度為2×105個/孔。細胞分為未感染組(n=3)和感染組(n=3),按照感染復數MOI=10的H37Ra Mtb感染巨噬細胞THP-1,培養4 h,棄上清,每孔加入1 ml新鮮RPMI-1640培養基,繼續培養,分別在感染0,6,12,24 h后,檢測各組miR-20a的表達。

1.2.4 細胞轉染及分組 取1.2.3中生長至對數期的感染組巨噬細胞THP-1,0.25%胰蛋白酶消化,接種至6孔板中,調整細胞濃度為6×105個/孔,細胞融合度達到80%時,更換為無血清RPMI-1640培養基。利用Lipofectamine 3000進行轉染,操作嚴格按照試劑說明書。轉染后用無血清RPMI-1640培養基繼續培養24 h,并分為感染組(只含有THP-1細胞),陰性轉染組(轉染濃度為100 nmol/L的miR-20a mimics-NC),miR-20a mimics組(轉染濃度為100 nmol/L的miR-20a mimics序列);另外選取未感染巨噬細胞THP-1作為未感染組。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞活力 取1.2.4中各組對數期細胞,調整細胞濃度為1×105個/ml,每孔100 μl加至96孔板中,每組設置6個重復,設置空白組僅添加細胞培養液,37 ℃、5%CO2培養箱中分別培養48 h后,加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃避光培養2 h,棄上清,酶標儀450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值,計算細胞活力(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(未感染組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取1.2.4中各組對數期細胞,培養48 h后,調整細胞濃度為5×105個/ml,每組設置3個重復,吸取200 μl細胞懸液至離心管中,預冷PBS清洗細胞2次,加入5 μl FITC-Annexin Ⅴ,輕混均勻,遮光孵育15 min;加入PI染液,輕混均勻,流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測細胞中miR-20a的表達 按照RNAiso Plus說明書對1.2.3中不同時間MOI=10細胞及1.2.4各組細胞中RNA進行提取,分光光度計測定RNA濃度,按照試劑盒說明書對RNA進行反轉錄cDNA,之后進行qRT-PCR反應,反應條件為預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 30 s,退火60 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 30 s,共計40個循環。以U6作為內參基因,采用2-ΔΔCt方法計算各組巨噬細胞THP-1中miR-20a相對表達量。引物設計見表1。

表1 引物序列

1.2.8 載體構建 Starbase數據庫顯示人TLR4基因3′UTR含與miR-20a的結合位點,對含結合位點TLR4區域進行擴增,連接到PGEM-T載體上,測序篩選;酶切并連至pGL4熒光素酶報告載體,構建pGL4-TLR4-3′UTR-WT質粒;以此質粒對模板進行定點缺失(Del:chr9 120477327-120477332位點)突變,測序確定突變成功,構建pGL4-TLR4-3′UTR-Del質粒。

1.2.9 雙熒光素酶報告系統分析 測序驗證成功的重組質粒pGL4-TLR4-3′UTR-WT、pGL4-TLR4-3′UTR-Del和miR-20a mimics-NC、miR-20a mimics分別共轉染至巨噬細胞THP-1中,每組設置3個重復,轉染6 h后,更換培養基。質粒共轉染36 h后,棄去培養基,PBS洗滌細胞;每孔加入50 μl的1×PLB,震蕩使細胞全部裂解;不透光96孔酶標板中每孔加上述上清液10 μl,加入100 μl雙熒光素酶反應試劑Ⅱ,檢測熒光素酶反應強度,記為A;測定結束后加100 μl Stop&Glo,檢測內參海腎熒光素酶反應強度,記為B。A/B數值為熒光素酶相對活性。

1.2.10 蛋白免疫印跡(Western blot,WB)法檢測蛋白表達 取1.2.4中各組細胞,培養48 h后調整濃度為5×105個/ml,每孔100 μl加至96孔板中,棄上清,PBS洗滌2次,重懸細胞,每組設置3個重復,蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,BCA試劑盒測定總蛋白濃度,蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉遮光封閉2 h;分別加入一抗稀釋液(Bcl-2、Bim、TLR4、MyD88、p-MAPK、MAPK、β-actin),均為1 ∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記二抗稀釋液(1 ∶2 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Mtb感染巨噬細胞THP-1后miR-20a的表達

與未感染組比較,Mtb感染組巨噬細胞THP-1中miR-20a表達顯著降低,且隨著感染時間的增加,miR-20a表達顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 Mtb感染巨噬細胞THP-1后miR-20a的表達

2.2 轉染效果檢測

與未感染組比較,感染組miR-20a表達顯著降低;與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組細胞miR-20a表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉染組比較,cP<0.05圖1 轉染miR-20a mimics后巨噬細胞THP-1中miR-20a表達Figure 1 Expression of miR-20a in macrophages THP-1 after transfection with miR-20a mimics

2.3 miR-20a對巨噬細胞活力的影響

與未感染組比較,感染組細胞活力顯著降低(P<0.05);與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組細胞活力顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

2.4 miR-20a對巨噬細胞凋亡的影響

與未感染組比較,感染組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組細胞凋亡率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖3,4)。

2.5 miR-20a對巨噬細胞Bcl-2、Bim蛋白表達的影響

與未感染組比較,感染組細胞蛋白Bcl-2表達顯著降低,Bim蛋白表達顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組細胞蛋白Bcl-2表達顯著升高,Bim蛋白表達顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05,見表3,圖5)。

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉染組比較,cP<0.05圖2 miR-20a對巨噬細胞活力的影響Figure 2 The effect of miR-20a on cell viability of macrophages

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉染組比較,cP<0.05圖3 miR-20a對巨噬細胞凋亡的影響Figure 3 The effect of miR-20a on apoptosis of macrophages

圖4 流式細胞術檢測miR-20a對巨噬細胞凋亡的影響Figure 4 The effect of miR-20a on apoptosis of macrophages by flow cytometry

表3 miR-20a對巨噬細胞中Bcl-2、Bim蛋白表達的影響

圖5 miR-20a對巨噬細胞Bcl-2、Bim蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miR-20a on Bcl-2, Bim protein expression in macrophages

2.6 miR-20a靶向調控TLR4基因的關系驗證

Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)數據庫預測結果表明,TLR4基因3′UTR區有miR-20a結合位點,位于chr9 120477327-120477332區域(見圖6A)。熒光素酶報告基因結果表明,與NC-pGL4-TLR4-3′UTR-WT組比較,mimics-pGL4-TLR4-3′UTR-WT組熒光素酶活性顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);mimics-p-GL4-TLR4-3′UTR-Del組熒光素酶活性無顯著性變化,差異無統計學意義(P>0.05,見圖6B)。

2.7 miR-20a對巨噬細胞TLR4通路蛋白表達的影響

與未感染組比較,感染組TLR4、MyD88、p-MAPK/MAPK水平顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組巨噬細胞TLR4、MyD88、p-MAPK/MAPK水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖7,表4)。

圖6 雙熒光素酶報告實驗驗證TLR4是miR-20a的靶基因Figure 6 Verification of target relationship between miR-20a and TLR4 by double luciferase reporter gene experiment

圖7 miR-20a對巨噬細胞TLR4通路蛋白表達的影響Figure 7 Effect of miR-20a on TLR4 pathway protein expression in macrophages

表4 miR-20a對巨噬細胞TLR4通路蛋白表達的影響

3 討論

巨噬細胞是機體抵御細菌入侵的第一道防線,其可通過病原體的PAMP識別入侵病原體,從而啟動抗感染的先天免疫反應[10]。細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程,在傳染性疾病中,病原體誘導的宿主細胞凋亡或抑制宿主細胞凋亡在疾病進展中有重要作用[11]。巨噬細胞凋亡是機體抵御Mtb感染的一種防御機制,能夠抑制Mtb的生長,進而限制Mtb在體內的傳播[12],另一方面,Mtb又能夠通過抑制巨噬細胞的凋亡,保護宿主細胞,從而為其在胞內生長提供有利的環境[13]。本研究結果表明Mtb感染后,巨噬細胞THP-1活性顯著低于未感染組,細胞凋亡率顯著高于未感染組,WB實驗進一步證明,與未感染組比較,感染后THP-1細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低,凋亡蛋白Bim表達顯著增加,說明Mtb感染可能會影響巨噬細胞的凋亡,影響細胞活性。

miRNA在人類傳染性疾病中有重要的作用,研究表明Mtb能夠通過調節miRNA的表達,影響細胞凋亡進而逃避免疫應答[14]。miR-20a屬于miR-17家族成員,多個研究表明miR-17家族成員與Mtb感染有關,如Kumar等[15]研究表明Mtb感染會導致miR-17的下調及其靶標Mcl-1和STAT3的上調,與Mtb感染的巨噬細胞的自噬有關。Guo等[16]研究表明miR-20a過表達抑制了巨噬細胞的自噬促進分枝桿菌的存活。本研究結果表明,感染Mtb后,巨噬細胞THP-1中miR-20a表達顯著降低,細胞凋亡率顯著升高,而轉染miR-20a mimics后Mtb感染的巨噬細胞THP-1凋亡率顯著降低,說明miR-20a過表達能夠抑制巨噬細胞的凋亡,從而加快病情進展,miR-20a表達可能在巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染中發揮重要作用。Zhang等[17]研究表明miR-20a過表達在Mtb誘導的巨噬細胞凋亡中起負調節的作用,抑制miR-20a表達可使感染的巨噬細胞THP-1更有效清除分枝桿菌,與本研究結果一致。本研究WB實驗進一步表明miR-20a mimics組Mtb感染的巨噬細胞THP-1抗凋亡蛋白Bcl-2水平顯著高于感染組,而凋亡蛋白Bim水平顯著低于感染組,進一步提示miR-20a過表達抑制Mtb感染的巨噬細胞的凋亡。

本研究利用Starbase數據庫對miR-20a靶基因進行預測發現,TLR4是miR-20a的潛在靶基因。TLR4基因位于9q 32-33,屬于Ⅰ型跨膜蛋白,由細胞外區、跨膜區及細胞內區三部分組成,廣泛分布于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等各種細胞表面。TLR4能夠與Mtb相互作用,與Mtb感染后巨噬細胞的免疫應答有關[18,19],Wu等[10]研究表明Mtb感染后巨噬細胞THP-1中TLR4、MyD88表達顯著高于未感染組。本研究結果表明,miR-20a可顯著抑制野生型TLR4熒光素酶活性,TLR4基因3′UTR區與miR-20a結合位點發生突變,可恢復熒光素酶活性,表明miR-30a可靶向調控TLR4基因。Chen等[20]研究表明miR-20a過表達顯著抑制人主動脈內皮細胞HAEC中TLR4和MyD88的水平,miR-20a可能通過負調控TLR4通路保護HAEC免受炎癥損傷。本研究進一步表明,與未感染比較,巨噬細胞THP-1感染Mtb感染后,其TLR4、MyD88蛋白表達顯著升高,而在轉染miR-20a mimics之后,與感染組和陰性轉染組比較,miR-20a mimics組細胞TLR4、MyD88、p-MAPK蛋白表達顯著降低,進一步說明miR-20a可能通過靶向調節TLR4信號通路進而影響巨噬細胞抗Mtb感染。

綜上所述,miR-20a在Mtb感染巨噬細胞THP-1中呈低表達,miR-20a過表達可能通過下調TLR4信號通路促進Mtb感染的巨噬細胞THP-1的凋亡,miR-20a低表達可能是Mtb清除的潛在機制。本研究僅測定了巨噬細胞THP-1中miR-20a、TLR4通路蛋白的表達,而對miR-20a靶向TLR-4的具體機制需進一步研究驗證。