馬齒莧酰胺E治療大鼠潰瘍性結腸炎的作用及其機制

黃 蕓,秦 榕,張志波,黃維康,王麗昆,王 輝

(昆明市延安醫院消化內科,昆明 650051;*通訊作者,E-mail:weihool@163.com)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種結腸受累的慢性炎癥性疾病,發病率在全球范圍內呈上升趨勢[1,2]。其主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、黏液膿血便。UC的病因和發病機制非常復雜,病程長易復發,活動期和緩解期常交替出現,難以治愈。研究表明氧化應激和免疫紊亂參與了UC的發生發展,這些發病機制的關鍵環節有可能成為新藥研發靶點[3,4]。馬齒莧是馬齒莧科馬齒莧屬植物,具有抗菌、鎮痛、抗炎、抗氧化、促進傷口愈合、修復潰瘍等多種藥理作用[5-7],已被廣泛用作食用植物和民間藥物[8]。國內外研究表明馬齒莧在UC臨床治療中潛力巨大。馬齒莧含有多種生物活性成分,其中酚類生物堿oleracein E(OE)是一種從馬齒莧中首次分離得到的四氫異喹啉,具有較強抗氧化活性[9]。然而OE對UC的影響還不清楚。因此,本研究擬通過三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠UC模型探討OE能否通過調節抗氧化酶活性和減輕炎癥反應來發揮治療作用。

1 實驗資料與方法

1.1 藥品與試劑

Oleracein E(貨號:561010)購自美國MedKoo公司。5%三硝基苯磺酸(TNBS)(貨號:P2297)購于美國Sigma公司。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(貨號:A044-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號:A001-3-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號:A003-1-2)、一氧化氮(NO)試劑盒(貨號:A012-1-2)和一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(貨號:A014-2-2)均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只,體質量(200±20)g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,生產許可證號:SCXK(湘)2016-0002。環境適應性飼養1周后用于試驗。大鼠的飼養、繁殖和使用均符合中國《實驗動物管理條例》。所有實驗均按照倫理準則進行。

1.3 主要儀器

Thermo Multiskan Spectrum全波長酶標儀(芬蘭Thermo Labsystem公司);T6型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);IKA-WERKE T8.01手握式組織勻漿器(德國IKA-WERKE公司);Eppendorf高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);電子恒溫水浴鍋(上海優浦科學儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及分組給藥 將SD大鼠隨機分為5組(n=12):正常組、TNBS組、OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組。大鼠吸入乙醚麻醉后將硅膠管(外徑2 mm)經肛門插入結腸內,頭端距肛門約8 cm,按100 mg/kg劑量緩慢注入預混的TNBS 50%乙醇溶液1 ml,正常對照組則注入生理鹽水1 ml。緩慢拔出硅膠管,夾閉肛門并將大鼠尾部提起倒置60 s,防止灌入液體流出。將OE溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液中配置成三種不同濃度備用(1.8,3.6,7.2 mg/ml)。OE低劑量組、OE中劑量組、OE高劑量組在造模后第3天開始分別按9,18,36 mg/kg灌腸給藥,每天1次,連續10 d。正常組和TNBS組灌腸給予等體積0.5% CMC-Na溶液。

1.4.2 結腸炎癥評估和標本制備 各組大鼠每天稱重。第14天頸椎脫臼處死,迅速開腹切除全結腸,沿腸系膜緣縱向切開,冷生理鹽水沖洗去除殘留糞便。立即將結腸平鋪于冰屑上,根據大體評分標準(見表1),對結腸黏膜損傷進行評分。取一小塊(0.5 cm×0.5 cm)病變明顯處結腸組織,用4%多聚甲醛固定24 h。其余病變明顯處結腸組織液氮速凍后移至-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。

表1 UC大鼠結腸黏膜大體損傷評分標準

1.4.3 組織病理學評估 多聚甲醛固定標本常規脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,封片后鏡檢,圖像采集分析。由兩位經驗豐富的病理醫生根據組織學評分標準(見表2)使用雙盲法進行評分。

表2 UC大鼠結腸黏膜組織學損傷評分標準

1.4.4 結腸組織中MPO、SOD、NOS、MDA和NO的測定 將儲存于-80 ℃的結腸組織制成10%的組織勻漿液。其中一份勻漿液用于測定MPO活性。剩余勻漿液在4 ℃下3 000g離心10 min后將上清液移入多個試管中,根據試劑盒說明書步驟測定SOD、MDA、NO和NOS的活性。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化及結腸損傷評分

實驗期間各組大鼠體質量變化見圖1。正常組大鼠體質量增長良好,大便正常,活動靈活。TNBS組大鼠精神狀態差,大便稀溏,飲食減少,體質量呈下降趨勢。OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組大鼠解黏液稀便情況得到不同程度改善,體質量有所回升。實驗結束時,TNBS組大鼠體質量與正常組相比差異有統計學意義(P<0.01,見圖2)。治療后OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組大鼠體質量顯著高于TNBS組(P<0.01,見圖2)。

圖1 實驗期間各組大鼠體質量變化Figure 1 The weight of rats in each group during the experiment

TNBS組、OE低、中、高劑量組大鼠結腸大體損傷評分與正常組相比明顯增加(P<0.01)。OE灌腸治療后,OE中、高劑量組大體損傷評分降低,與TNBS組比較差異有統計學意義(P<0.01),而OE低劑量組與TNBS組比較差異無統計學意義(見圖3)。

正常組結腸壁各層結構完整,黏膜上皮腺體規則,杯狀細胞豐富;TNBS組結腸組織表現為大片狀黏膜層缺失、脫落,黏膜下層明顯水腫,彌漫性炎性細胞浸潤;OE低、中、高劑量組結腸組織的炎性細胞浸潤和黏膜層缺損較TNBS組減少,腸黏膜水腫及潰瘍減輕(見圖4)。

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖2 實驗結束時各組大鼠體質量比較Figure 2 Comparison of body weight of rats at the end of the experiment between groups

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖3 各組大鼠結腸大體損傷評分比較Figure 3 Comparison of colonic gross injury scores between groups

A.正常組;B.TNBS組;C.OE低劑量組;D.OE中劑量組;E.OE高劑量組;紅色箭頭表示黏膜層脫落缺失,黑色箭頭表示中性粒細胞彌漫性浸潤圖4 OE治療后各組大鼠結腸黏膜組織病理學變化 (IHC,×400)Figure 4 Histopathological changes of colonic mucosa in rats after OE treatment (IHC,×400)

與正常組相比,TNBS組、OE低、中、高劑量組大鼠結腸的組織學損傷評分均明顯增加(P<0.01)。OE中、高劑量組在OE治療后組織學損傷評分顯著低于TNBS組(P<0.01,見圖5)。

2.2 OE對大鼠結腸組織MPO、MDA、SOD、NO和NOS的影響

TNBS組、OE低、中、高劑量組MPO活性較正常組顯著升高(P<0.01)。OE高劑量組和OE中劑量組MPO活性顯著低于TNBS組(P<0.01),OE低劑量組與TNBS組之間差異無統計學意義(見圖6)。

與正常組比較,TNBS組SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.01)。與TNBS組比較,OE高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.01),OE高劑量組和OE中劑量組MDA水平顯著降低(P<0.01),而OE低劑量組與TNBS組比較差異無統計學意義(見圖6)。

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖5 各組大鼠結腸組織學損傷評分比較Figure 5 Comparison of histological injury scores of colon between groups

與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖6 OE對各組大鼠結腸組織MPO、MDA、SOD、NO和NOS的影響Figure 6 Effects of OE on MPO, MDA, SOD, NO and NOS in colon tissue of rats in each group

TNBS組、OE低、中、高劑量組NOS活性和NO水平較正常組顯著升高(P<0.01)。與TNBS組比較,OE低、中、高劑量組NOS活性和NO水平均呈下降趨勢。與TNBS組比較,OE三個劑量組NOS活性均有所下降,但組間差異無統計學意義。而OE高劑量組NOS活性與正常組之間差異無統計學意義(見圖6)。此外,OE高劑量組NO水平較TNBS組顯著降低(P<0.01),而OE低劑量組和OE中劑量組與TNBS組之間差異無統計學意義(見圖6)。

3 討論

UC作為一種多因素參與、機制不明的消化系統疑難疾病,臨床治療一直面臨巨大挑戰。近年來,中醫藥因其副作用小、復發率低等優勢被廣泛應用于UC治療,收效良好。UC患者中約63%表現為末段結腸炎,包括直腸炎、左半結腸炎。在眾多方案中,包括灌腸在內的局部治療對輕中度末段結腸炎患者有良好的療效和安全性[10]。我們的前期研究顯示馬齒莧灌腸能夠明顯改善TNBS誘導的大鼠結腸炎[11]。另一項研究表明,口服馬齒莧乙醇提取物對硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎有預防和治療作用[12]。由此可見馬齒莧外用內服對UC均有一定治療作用。

MPO是一種主要存在于中性粒細胞中的酶,其活性測定已被用作胃腸道中性粒細胞浸潤的評估指標。研究表明,TNBS誘導的UC大鼠結腸組織中MPO活性顯著升高,提示存在中性粒細胞募集和急性炎癥反應。OE灌腸治療可呈劑量依賴性減少結腸組織中性粒細胞浸潤,提示與其抗炎作用有關。炎性細胞浸潤是自由基釋放的觸發因素。生理條件下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)受大量抗氧化系統調控。炎癥性腸病中腸道ROS顯著增加。ROS和抗氧化系統之間的平衡失調導致氧化應激反應加劇,促進了UC的發生發展。機體質量要的抗氧化酶包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。MDA是一種典型的脂質過氧化標志物。SOD是機體抵御ROS的第一道防線,能催化O2生成H2O2。H2O2在CAT、GSH-Px和過氧化物氧還蛋白(Prx)的作用下轉化為H2O和O2。已有研究證實OE具有抗凋亡、減少氧化應激和下調應激相關分子表達等作用[13,14]。本研究表明OE提高了結腸組織的抗氧化能力,提示OE能夠抑制脂質過氧化,從而發揮結腸炎癥的治療作用。

NO具有多種生物學功能,包括維持血管內穩態、宿主防御和神經傳遞等。過量NO卻有促炎和細胞毒性作用。NO還可誘導IL-8、TNF-α和IL-1β釋放。此外,炎癥腸道的超氧化物明顯增加。NO與超氧化物反應可能導致體內生成更強的氧化劑過氧亞硝酸鹽。研究已證實過氧亞硝酸鹽與炎癥性腸病的發病有關。本研究提示治療組NO生成減少,NOS活性下降,推斷OE可通過抑制過氧亞硝酸鹽形成和炎性細胞因子釋放,直接或間接減輕UC的炎癥反應。

綜上所述,OE灌腸治療能夠有效改善TNBS誘導的大鼠結腸炎。其作用機制可能與修復結腸黏膜損傷、增強抗氧化能力、減輕腸道炎癥反應有關。本研究為篩選馬齒莧有效成分、探討作用機制及其臨床應用提供了一定的理論基礎。