槲皮素對膠原誘導性關節炎大鼠滑膜血管新生的影響

褚小磊,柴繼俠,郭 帥,王元元,陳傳好*

(1蚌埠醫學院人體解剖學教研室，蚌埠 233030；2組織移植安徽省重點實驗室；3蚌埠醫學院組織學與胚胎學教研室；4感染與免疫安徽省重點實驗室；*通訊作者,E-mail:cch711124@sina.com；#共同通訊作者，E-mail:wanyuanyuantcm@126.com)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是常見的自身免疫性炎癥性關節病[1]。目前認為主要的病因包括遺傳學、表觀遺傳學、環境、生活方式的改變，這些因素共同導致慢性炎癥、血管新生、關節破壞，甚至引起進展性殘疾、全身并發癥、早期死亡[2]。血管新生(angiogenesis)是從現有血管重生新血管，是新組織發育、生長和組織修復的重要方面，在RA早期階段起著關鍵作用[3]。近年來，許多研究證明血管新生在炎癥和免疫應答持續存在的過程中發揮著重要作用，并支持RA血管翳生長和發展[4]。同時，已有研究表明在RA中阻斷血管新生可以抑制滑膜炎癥以及血管翳形成[5-7]。有針對性的免疫治療和積極的治療策略大大改善了病情的進展，但目前還沒有治愈的方法，同時，服用這類藥物通常會發生各種不同的副作用，且費用高，這使得臨床應用受到限制[8]。亟待尋找新型潛在的藥物。槲皮素(quercetin，QUE)是眾多天然類黃酮化合物中的一種，存在于多種水果和蔬菜中，具有獨特的生物學特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、免疫調節[9,10]，以及抑制毛細血管通透性和預防骨質疏松癥[11]，同時毒副作用小，可以作為一種有前景的安全治療策略[12]。在RA中進行的一系列體內外研究表明，槲皮素通過多種途徑影響RA疾病的進展。因此，本文研究槲皮素在RA中是否具有抗血管新生作用，以及潛在的機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

槲皮素(純度98%)和DMSO(純度99%)分別購自美國MedChemExpress公司和德國Biofroxx公司。不完全弗氏佐劑(IFA)和牛Ⅱ型膠原(C Ⅱ)獲自美國Chondrex公司。兔抗大鼠HIF-1α、兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠VEGFA和二抗(山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶)、ELISA試劑盒均購買自武漢Abclonal公司。一抗β-actin、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、ECL化學發光底物試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA裂解緩沖液均產于上海Beyotime公司。山羊血清購買于武漢Elabscience Biotechnology公司。檸檬酸鈉抗原修復液、蘇木精、伊紅染料購自北京Solarbio公司。

1.2 動物

從濟南朋悅實驗動物繁育有限公司獲得24只SPF級雄性SD大鼠(體質量180-220 g)，合格證號：SCXK(魯)20190003。飼養溫度26-28 ℃，光照12 h，均自由進食和飲水，適應性喂養1周后在無菌環境中進行整個實驗。該研究所有協議均由蚌埠醫學院動物實驗倫理委員會審查和批準(審查編號2020-084)。

1.3 方法

1.3.1 膠原誘導大鼠關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的建立和槲皮素治療 為明確槲皮素對關節炎的影響，采用SD大鼠通過以下步驟[13]建立CIA模型：C Ⅱ溶解于0.01 mol/L醋酸中配制成2 mg/ml濃度，在4 ℃下過夜，然后與等體積的2 mg/ml IFA充分乳化后于第0天在大鼠尾根部皮內注射(0.2 ml)誘導炎癥(初次免疫)。初次免疫后第7天，在大鼠右后肢皮內注射相同體積的該乳劑，以增強初次免疫(第2次免疫)。將無關節腫脹體征的動物移除。CIA大鼠隨機分為：CIA組(n=6)和QUE組(n=6)，并選擇6只正常大鼠作為正常對照組(control)。以往研究表明，在CIA大鼠模型中，給予QUE(150 mg/kg)可顯著改善大鼠關節炎癥[14]，所以本實驗采用該劑量灌胃。在初次免疫后第14天，每天1次，直至實驗結束(初次免疫后35 d)，QUE粉末溶解于0.05% DMSO溶液中，QUE組按150 mg/kg體質量(下同)經口灌胃給藥；control組和CIA組僅給予等體積0.05% DMSO溶液。

1.3.2 關節炎評價 關節炎病變程度參考文獻評分標準進行評估[15]。在初次誘導后的第14天開始，每3 d由兩個獨立的觀察者進行關節炎評分的評估：0分，沒有紅腫；1分，腳趾和腳踝輕度腫脹；2分，腳趾和腳踝中度腫脹；3分，腳趾和腳踝嚴重腫脹；4分，整個腳掌腫脹，有強直。四只足爪的得分相加，最大得分為16分，表示最嚴重的程度，同時測量每只大鼠左后肢足爪體積以及大鼠體質量，直至實驗結束。

1.3.3 組織病理學評估 初次免疫后第35天，在10%水合氯醛麻醉后，通過頸椎脫臼法處死大鼠。解剖雙后肢踝關節，立即在4%多聚甲醛中固定24 h。在4 ℃下，10% EDTA中脫鈣處理1個月，每隔1 d更換脫鈣液。包埋在石蠟中，組織切片(4 μm)固定在普通玻片上，蘇木精伊紅(HE)染色。由兩名專業的病理學觀察者對所有切片進行隨機分組和評價，觀察者對給藥組和每只大鼠的關節炎嚴重程度設盲。數據表示為平均滑膜炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、軟骨侵蝕評分。使用5個高倍放大視野(HPFs)平均值評分進行分析，關節組織病理學評分見表1[16]。

表1 關節組織病理學評分

1.3.4 免疫組織化學(IHC)檢測CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表達 采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-biotin-peroxidase，SP)法進行操作。將組織石蠟切片在68 ℃下烘烤20 min。用二甲苯對組織進行脫蠟，梯度乙醇(由高到低)水化，將切片浸泡在檸檬酸鈉抗原修復液中，95 ℃加熱約15 min，隨后用0.3%過氧化氫處理以阻斷內源性過氧化氫酶活性，然后用PBS溶液洗滌3次×5 min，添加山羊血清封閉液后在室溫下放置20 min，用PBS溶液浸洗3次×3 min后分別將切片與CD34(1 ∶100)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)(1 ∶150)、HIF-1α(1 ∶200)的一抗孵育在4 ℃下過夜，再次用PBS溶液浸洗5次×5 min，然后用相應的二抗在37 ℃孵育1 h，接著用PBS洗滌。使用二氨基聯苯胺(DAB)進行著色，蘇木精復染2 min，常規脫水，透明和固定后中性樹膠封片，最后進行顯微鏡觀測。使用血管內皮細胞特異性抗原CD34作為檢測指標，對踝關節4 μm厚石蠟包埋切片進行微血管和單內皮細胞染色。基于0-3等級評分(見表1)，觀察滑膜微血管密度，并評估滑膜組織CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表達情況，在200倍光學視野下選擇最豐富的血管區域，然后在400倍光學視野下計數5個高微血管密度區域的并取平均值。用Image Pro Plus 6.0軟件進行累積光密度(IOD)評估，結果表示為平均感興趣區域，表示在放大倍數為400倍時每張圖像被陽性染色細胞覆蓋的面積百分比[17]。

1.3.5 免疫印跡(Western blotting)檢測VEGFA和CD34蛋白表達 在初次免疫后第35天，無菌環境下分離大鼠膝關節滑膜，簡言之，大鼠在10%水合氯醛麻醉后，固定下肢、消毒、鋪巾，沿髕骨前方縱行切開皮膚及皮下組織，暴露髕韌帶，沿髕骨下緣橫斷髕韌帶，暴露并分離滑膜，淡黃色的軟組織即為滑膜(見圖1)。在RIPA裂解緩沖液中使用組織研磨機裂解關節滑膜組織，并在12 000g下離心10 min，得到蛋白提取物，使用BCA法測定蛋白濃度。通過6%和12% SDS-PAGE電泳分離關節滑膜組織蛋白，并轉移至0.45 μm PVDF膜上，用3%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，一抗(VEGFA、CD34、β-actin)分別按1 ∶500、1 ∶500、1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗3次，每次10 min，二抗按1 ∶8 000稀釋，室溫下孵育2 h，TBST溶液洗3次。使用ECL化學發光底物試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統對膜進行曝光并獲取圖像。

A.固定、消毒、鋪巾 B.切開皮膚及皮下組織 C.切開髕韌帶、分離暴露滑膜 D.獲取滑膜圖1 大鼠關節滑膜組織的分離和提取Figure 1 Isolation and extraction of rat synovial tissue

1.3.6 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-17表達水平 在初次免疫后第35天采集大鼠血清，3 000 r/min離心15 min后，使用ELISA試劑盒(武漢Abclonal公司)，在450 nm和570 nm處測定吸光度，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-17表達水平。每個指標進行3次重復實驗。

2 結果

2.1 槲皮素可延緩CIA大鼠關節炎進展并降低關節炎嚴重程度

從初次免疫后第14天開始，觀察到CIA組大鼠關節明顯腫脹，槲皮素治療后關節腫脹明顯減輕(見圖2)。CIA組大鼠關節炎評分逐漸升高，在第30天左右達到高峰與control組比較，差異有統計學意義(P<0.001)；QUE組大鼠關節炎評分在初次免疫后第26天開始，評分逐漸下降,與CIA組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2)。從第14天開始，CIA組大鼠體質量逐漸下降，在第23天左右達到最低，之后升高并維持相對較低的水平，與control組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2)；QUE組大鼠體質量從初次免疫后第26天開始逐漸上升，但是與CIA組相比無明顯差異。CIA大鼠左后足體積從第14天開始升高，與control組比較，差異有統計學意義(P<0.01，見圖2)；與CIA模型組相比較，從初次免疫后第20天開始，槲皮素能顯著降低關節炎大鼠足爪體積(P<0.05，見圖2)。

2.2 槲皮素減輕CIA大鼠關節組織病理學改變

HE染色結果顯示，正常對照大鼠踝關節結構正常，滑膜無增生、水腫，關節軟骨表面光滑，未見血管翳，軟骨基質和軟骨細胞無損壞；CIA大鼠具有顯著的關節炎組織病理學變化，包括炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳以及骨、軟骨破壞；然而，槲皮素治療明顯減輕CIA大鼠的關節炎組織病理學變化(見圖3)。

與control比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001圖2 槲皮素對CIA大鼠關節炎評分、體質量、足爪體積影響Figure 2 Effect of quercetin on arthritis score, body weight and foot and paw volume in CIA rats

與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01圖3 槲皮素對CIA大鼠關節炎發病過程及組織病理學變化的影響Figure 3 Effect of quercetin on the pathogenesis and histopathological changes of arthritis in CIA rats

與CIA組比較，QUE組CIA大鼠踝關節組織病理學嚴重程度評分、滑膜炎性評分、滑膜增生評分、血管翳評分、軟骨侵蝕評分均明顯降低(P<0.05，見圖3)。

2.3 槲皮素抑制CIA大鼠關節滑膜組織血管新生

CIA組大鼠炎癥關節滑膜組織中存在大量CD34、VEGFA、HIF-1α陽性染色，而QUE組大鼠炎癥關節滑膜組織中的CD34、VEGFA、HIF-1α染色明顯減弱(見圖4)。統計結果表明，與control組比較，CIA大鼠關節滑膜組織中的微血管密度以及CD34、VEGFA、HIF-1α的表達均升高(均P<0.01，見圖4)；與僅接受0.05% DMSO溶液給藥的CIA大鼠相比，150 mg/kg槲皮素可顯著降低CIA大鼠炎癥關節滑膜組織中的微血管密度以及滑膜組織中CD34、VEGFA、HIF-1α的表達(均P<0.01，見圖4)。

2.4 槲皮素對CIA大鼠關節滑膜中VEGFA、CD34的影響

采用Western blotting分析檢測滑膜組織中VEGFA和CD34蛋白表達水平。結果表明，與control組相比，CIA組大鼠關節滑膜中VEGFA和CD34的表達升高(P<0.01，見圖5)。相比于CIA組，QUE組CD34表達無明顯變化，VEGFA表達明顯降低(P<0.01，見圖5)。

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，##P<0.01圖4 槲皮素對CIA大鼠關節滑膜中微血管密度以及CD34,VEGFA,HIF-1α的影響Figure 4 Effect of quercetin on density of synovial blood vessels in collagen-induced arthritis rats and expression of CD34, VEGFA, HIF-1α in joint synovium

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，##P<0.01圖5 Western blotting檢測槲皮素對CIA大鼠關節滑膜中VEGFA、CD34的影響Figure 5 Effect of quercetin on VEGFA and CD34 in the synovium of CIA rats by Western blotting

2.5 槲皮素對CIA大鼠血清TNF-α和IL-1β、IL-17水平的影響

采用ELISA檢測初次免疫后第35天大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17的表達水平。結果表明，與control組相比，CIA組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17水平升高(P<0.01，見圖6)。與CIA組比較，槲皮素組CIA大鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-17明顯抑制(P<0.05-0.01，見圖6)。

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01圖6 槲皮素對血清TNF-α、IL-17、IL-1β水平的影響Figure 6 Effect of quercetin on plasma levels of TNF-α, IL-17 and IL-1β

3 討論

RA是一種復雜的免疫介導疾病，臨床表現主要涉及滑膜炎癥和關節損傷。大約每千人中有5例發生，并可能導致嚴重的關節損傷和殘疾[18]。目前在藥物治療方面，非甾體抗炎藥或止痛藥以及糖皮質激素類藥物并不能阻止損傷的進展和不可逆轉的殘疾，而只改善癥狀，抗風濕藥物(DMARDs)分為合成的(口服小化學分子)和生物的(非腸道注射的蛋白質)制劑，使用DMARDs治療可以干預RA的體征和癥狀，改善身體功能，并抑制關節損傷進展[19]。但是每一種藥物效價是有限的，研究表明，將近40%的類風濕性關節炎患者實現了低活動性，約20%的類風濕性關節炎患者得到緩解。且大多數生物DMARDs和靶向合成DMARDs都存在感染風險等副作用。除此之外，高昂的費用也限制了這些藥物的使用[20]。所以需要尋找潛在的藥物以改善RA疾病的進展。

具有抗氧化和抗炎性質的天然化合物可被用作治療關節炎[21]。槲皮素是在水果、蔬菜、漿果和紅茶中含量豐富的主要天然類黃酮化合物之一，已證實槲皮素具有抗癌、抗氧化和抗炎特性[22]。研究發現，在體外實驗中槲皮素可以促使類風濕滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLSs)凋亡[23,24]，并抑制其增殖[25]。在大鼠CIA模型中，以150 mg/kg劑量經口給予槲皮素能夠顯著下調腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[26]。在雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)模型中槲皮素能夠抑制血管新生[27]。研究還發現槲皮素可以抑制血管新生發揮抗腫瘤作用[28]。血管新生在RA發病機制中起到關鍵作用[3]。因此，靶向血管新生對RA治療有很大的潛力。然而，對于槲皮素能否減緩RA血管新生進程的研究相對不足，所以該研究旨在明確槲皮素對于RA血管新生的影響，并進一步了解其作用機制和潛在的治療靶點，以便有效地將槲皮素用于RA的治療。

膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)與RA在臨床發病以及病理表現方面存在較多相似的特征，是研究RA發病機制最常用的動物模型[29]。本研究中，大多數大鼠在初次免疫后約14 d出現CIA典型的足爪發紅、腫脹(見圖2)。而在槲皮素處理的大鼠中，觀察到平均關節炎評分和足爪體積明顯降低，從而關節炎的嚴重程度明顯減弱。此外，關節組織病理學結果表明，槲皮素治療可顯著改善CIA大鼠關節的炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨侵蝕(見圖3)。這些病理變化是RA重要的特征表現。ELISA結果表明，槲皮素可以降低CIA大鼠關節滑膜中的細胞因子的釋放，從而減輕關節炎癥(見圖6)。綜合這些結果表明，槲皮素能夠有效阻止CIA大鼠關節炎進展并降低關節炎的嚴重程度。

血管新生在RA中主要參與血管翳形成并維持滑膜的浸潤[30]。本研究中，為了評估槲皮素產生抗血管新生作用，通過免疫組織化學對關節滑膜組織中用于可視化血管新生的標志物CD34進行染色。槲皮素治療后，CIA大鼠關節滑膜組織中微血管密度顯著降低(見圖4)。這表明槲皮素能在CIA中發揮有效的抗血管新生作用。本文進一步探索槲皮素在CIA中發揮抗血管新生的的潛在機制。以往的體外和體內研究證實，血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)作為效果突出的促血管生成因子，在RA滑膜組織中高表達[5]。VEGFA結合其受體，通過一系列信號轉導，對血管內皮細胞發揮特異性作用，包括釋放多種生長因子和炎性因子，加速內皮細胞增殖和遷移，參與新血管的調節和生成，最終導致大量新生血管產生[31]。VEGFA在RA的發病機制中發揮重要作用[32]。VEGFA的表達下調可明顯減輕血管生成以及滑膜炎癥[33]。同時，RA關節缺氧環境與滑膜血管過度形成相互影響。低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在缺氧條件下大量表達，可促進缺氧增加的炎性細胞因子的產生，促進血管生成、侵襲和轉移[34]。研究表明，在CIA大鼠中抑制HIF-1α可減少大鼠關節炎癥和血管生成[33]。本研究IHC與Western blotting實驗結果均顯示槲皮素在體內可以抑制CIA大鼠滑膜中VEGFA的表達。同時在IHC實驗中還發現槲皮素可以抑制HIF-1α、CD34的表達(見圖4)，而在Western blotting實驗中CD34的表達沒有明顯變化(見圖5)。

總之，本文結果表明，槲皮素可能通過下調HIF-1α和VEGFA的表達，在體內對RA產生抗血管新生作用。這些發現對槲皮素在RA發病機制中的作用的提供了進一步認識，并表明槲皮素可能是治療RA的一種有潛力治療藥物。