龜齡集延緩果蠅衰老的作用研究

段麗娟,范慧君,邢 婕,張愛榮,高曉霞,秦雪梅*

(1山西大學中醫藥現代研究中心,太原 030006;2山西大學化學化工學院;3山西廣譽遠國藥有限公司;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

龜齡集是我國補腎填精、壯陽培本的傳統古方,其處方復雜獨特,由二十八味中藥組成,涵括了動物藥、植物藥和礦物藥,其功能主治為強身補腦,固腎補氣,增進食欲,用于腎虧陽弱,記憶減退,夜夢遺精,腰酸腿軟,氣虛咳嗽,五更溏瀉,食欲不振[1]。現代藥理實驗多集中在治療少精癥、勃起障礙、腎陽虛等男性疾病[2-5]。

在《中國長壽大辭典》中,龜齡集列益壽強身內服藥之首[6],也是著名的抗衰老處方[7],具有延緩衰老的作用[8],已有研究表明龜齡集可改善大鼠衰老引起的記憶障礙作用[9]。也有研究報道龜齡集可顯著延長雌雄蠶蛾的壽命[10],然而家蠶與哺乳動物差異較大,且對龜齡集的用藥方法、用藥劑量未詳細考察。目前,龜齡集的臨床使用劑量、服用療程及受眾年齡等多始于歷史傳承,但由于實驗周期長等客觀因素,其發揮延年益壽的作用的研究報道較少。

壽命是抗衰老作用研究中最直觀、最重要的指標,壽命實驗(生存實驗)是衡量生命衰老規律和抗衰老效果的方法。果蠅遺傳學知識背景深厚并且具有壽命短的優勢,且果蠅具有與人類75%同源疾病相關基因,為生物實驗的理想材料,現果蠅的生存實驗已被作為延緩衰老作用的檢驗方法之一[11-14]。

本研究使用果蠅生物模型,考察篩選給藥劑量和時長及給藥方式,最終確定龜齡集延長果蠅壽命的最佳方法,為龜齡集臨床更合理科學用藥提供參考。本研究采用逆重力爬行實驗及抗冷應激實驗評價龜齡集的抗衰老活性,為龜齡集的抗衰老作用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

果蠅品系:W1118系白眼黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)山西大學應用生物學研究所提供,在25 ℃、75%相對濕度,光照周期為12 h的恒溫恒濕環境中培養。將CO2氣體通入果蠅培養瓶中將其致暈,放在通有CO2的脫脂棉上,分取雄性并收集。

1.2 試劑及儀器

龜齡集(批號:20130201,規格:0.3 g/粒),由山西廣譽遠國藥有限公司提供,實驗時藥物均合格。

電子天平(型號:FA2004,上海良平儀器儀表有限公司);人工氣候箱(型號:MGC-HP,上海一恒科技有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(型號:LDZX-30KBS,上海申安醫療器械廠)。

1.3 培養基的配制

基礎培養基的配制:參考文獻基礎培養基的配制方法[15],將培養基趁熱裝入洗凈滅菌的指管(高9.4 cm,內徑2.6 cm)中,每管加入約5 ml,于干燥實驗室自然晾干后室溫下保存備用。

龜齡集培養基的配制:在基礎培養基里加入龜齡集藥粉,充分攪拌,制成0.5,1,2,4,8 mg/ml龜齡集培養基。

1.4 果蠅壽命實驗

1.4.1 不同劑量龜齡集對果蠅壽命的影響 參考文獻[16]方法,收集3 d內羽化的雄性果蠅,使用基礎培養基培養至30日齡時隨機分組,即對照組和龜齡集組(含藥劑量分別為0.5,1,2,4,8 mg/ml),果蠅30日齡時開始給藥,直至果蠅自然衰老死亡。每組約200只,隔3 d為果蠅更換1次新鮮培養基,每日記錄果蠅死亡狀況直至全部死亡,意外死亡果蠅不作統計。每組果蠅的平均存活天數計為平均壽命,每組最后剩余10%果蠅的存活天數算術平均數計為最高壽命。

1.4.2 不同給藥方式對果蠅壽命的影響 收集3 d內羽化的雄性果蠅,使用基礎培養基培養至30日齡時隨機分為對照組和龜齡集組(4 mg/ml)。將龜齡集給藥時長設置為15 d,設計兩種給藥方式,分別為連續給藥15 d后停藥和間隔1 d給藥,每組130只左右。分別用基礎培養基及龜齡集培養基喂養,每天記錄果蠅死亡狀況,直至全部死亡,意外死亡果蠅不作統計。

1.5 逆重力爬行實驗

收集3 d內羽化的雄性果蠅,使用基礎培養基培養至30日齡時隨機分為對照組和龜齡集組,每組果蠅約100只。對照組使用基礎培養基飼喂,龜齡集組使用4 mg/ml的龜齡集培養基飼喂至40日齡時,將果蠅轉入高9.4 cm,內徑2.6 cm的空管中,其中塑料管共分為4段,每段2 cm。將待測果蠅平均裝入測定管中,饑餓2 h后輕晃管,使果蠅置于底部。統計30 s后爬行距離大于4 cm的果蠅數量(A),計算攀附指數(climbing index,CI)=A/總數[17]。分別測定兩組果蠅30日齡和40日齡時的攀附指數,并計算兩組果蠅不同年齡下的攀附指數提高率,每組果蠅分別測定3次,每次間隔20 min。

1.6 抗冷應激實驗

收集3 d內羽化的雄性果蠅,使用基礎培養基培養至30日齡時隨機分為對照組和龜齡集組,每組果蠅約100只。對照組與龜齡集組分別使用基礎培養基和膳食中添加4 mg/ml的龜齡集培養基飼喂至40日齡時,將果蠅轉移至室溫下放置的空管中進行爬行實驗,統計30 s后爬行距離大于4 cm的果蠅數量,記錄數據并計算攀附指數。將果蠅迅速轉移至碎冰上冷刺激10 s后,立即輕晃管進行爬行能力測定,爬行30 s后記錄爬行距離大于4 cm的果蠅數量并計算攀附指數。計算兩組果蠅冷刺激環境下較常溫環境中攀附指數的提高率,每組果蠅分別測定3次,每次實驗間隔20 min。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 龜齡集對果蠅壽命的影響

2.1.1 不同劑量龜齡集對果蠅壽命的影響 不同劑量龜齡集對果蠅壽命的影響結果見圖1。在果蠅30-45日齡段,0.5,4,8 mg/ml龜齡集組曲線高于對照組,其他實驗組曲線與對照組曲線幾近重疊。而在果蠅壽命后期,各劑量組的存活率均低于對照組。推測龜齡集給藥時間不宜過長，故后續實驗將龜齡集給藥時長定為15 d。

圖1 龜齡集各劑量組與對照組生存曲線Figure 1 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster between different Guilingji dose groups and control group

與對照組相比,0.5,4,8 mg/ml龜齡集組果蠅的平均壽命與中位壽命可不同程度地延長(見表1)。4 mg/ml龜齡集組果蠅的平均壽命和中值壽命較對照組分別延長了1.97%和4.44%,但差異沒有統計學意義(P>0.05)。4 mg/ml龜齡集劑量組平均壽命和中值壽命的延長率大于0.5,8 mg/ml組,故4 mg/ml為最佳劑量,后續實驗均采用此劑量。

2.1.2 不同給藥方式對果蠅壽命的影響 不同給藥方式對果蠅壽命影響結果見表2,圖2。與對照組相比,采用連續給藥方式的龜齡集組果蠅存活率得到顯著提高(見圖2A)。果蠅的平均壽命、中位壽命、最高壽命較對照組分別延長了16.0%,17.0%,7.7%,且差異有統計學意義(P<0.01,見表2)。與對照組相比,采用間隔給藥方式的龜齡集組果蠅存活率出現先高后低的趨勢(見圖2B)。龜齡集組較對照組可分別延長果蠅的平均壽命5.0%(P<0.01),延長中位壽命4.3%(P<0.05),而最高壽命無改善(見表2)。

表1 龜齡集不同劑量對果蠅壽命的影響

表2 龜齡集不同給藥方式對果蠅壽命的影響

A.龜齡集連續15 d給藥 B.龜齡集間隔1 d給藥圖2 龜齡集不同給藥方式果蠅生存曲線的比較Figure 2 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster after Guilingji administration with different methods

2.2 龜齡集對果蠅爬行能力的影響

與對照組相比，龜齡集組30日齡和40日齡果蠅的攀爬能力無明顯提高，差異無統計學意義(P>0.05,見表3)。尚不能證明龜齡集給藥15 d對果蠅攀爬能力有影響。

2.3 龜齡集對果蠅冷應激能力的影響

龜齡集對40日齡果蠅冷應激能力的影響結果見表4。對照組與龜齡集組在常溫下攀附指數的差異無統計學意義，表明兩組果蠅常溫環境下的攀爬能力相當。與對照組相比，龜齡集組在冷刺激下果蠅的攀附指數明顯提高，且差異有統計學意義(P<0.05)。實驗結果表明龜齡集可提高果蠅的抗冷應激能力。

表3 龜齡集對果蠅爬行能力的影響

表4 龜齡集對果蠅冷應激能力的影響

3 討論

龜齡集組方依據傳統醫學“天人合一”、“陰陽五行”的整體觀念,包含了植物藥(紅參、天冬、杜仲等)、動物藥(鹿茸、海馬、雀腦等)和礦物藥(大青鹽、石燕等)。龜齡集作為藥品,臨床上按照療程用藥。而作為養生名方,采用四季養生服用法,即“四立二分二至法”,立春、立夏、立秋、立冬、春分、秋分、夏至、冬至,每個節氣按照劑量連服15 d,或二至(夏至、冬至)每個節氣按照劑量連服45 d。動物實驗不能考察時令因素對藥效的影響,但可以通過考察合適的給藥方法來評估龜齡集藥效。

龜齡集在臨床應用時多為男性用藥,同時為避免雌性果蠅生殖等其他因素的影響,故本研究選取雄性果蠅為實驗對象。本研究結合臨床,采用果蠅自然衰老模型,考察了不同的給藥劑量和給藥方式2種條件,最終得到了于果蠅模型適合的給藥方法。

3.1 果蠅模型的優勢與給藥劑量的篩選

果蠅作為常用的衰老模式生物之一,具有生命周期短而繁殖快,飼養方便且諸多代謝途徑、生理功能類似于哺乳動物的優點。然而目前果蠅并未像大鼠、兔子等動物一樣與人類之間有科學的藥物劑量換算標準,故給藥劑量需進行實驗篩選確定。前期實驗設計了0.04,0.2,1 mg/ml三個劑量組,生存曲線結果未觀察到明顯變化。根據此結果,將給藥劑量設計為0.5,1,2,4,8 mg/ml。結果顯示,0.5,4,8 mg/ml劑量可改善果蠅壽命情況,但考慮到0.5 mg/ml劑量較小,藥效發揮可能不太穩定,而4 mg/ml和8 mg/ml兩個劑量顯示出劑量依賴性趨勢,其中,4 mg/ml劑量組還可明顯提高果蠅的平均壽命和中位生存時間,故采用4 mg/ml進行后續試驗研究。

3.2 給藥時長的選擇

本課題組前期對果蠅進行代謝組學分析時發現，果蠅在壽命為30日齡時屬于中年階段，30日齡果蠅已經開始步入衰老[16]。故選擇從30日齡開始給藥，這也與龜齡集在臨床使用中一般為中老年用藥的經驗一致。

在劑量篩選實驗中發現龜齡集可提高果蠅30-45日齡的存活率，推測龜齡集給藥時長不宜過長。因此，將給藥時長設置為15 d。

3.3 給藥方式的考察

中華民族在中醫藥理論的指導下,形成了一套完整的養生體系。二十四節氣反映了大自然的氣候變化,中醫學將二十四節氣與陰陽學說相結合,以陰陽相衡為原則,在四立二分二至時服用養生補健方以達到延年益壽、滋心肺潤五臟的目的。考慮到臨床實際使用的“四時養生”服用法,實驗中還比較了隔天給藥的給藥法,但其延長壽命結果不明顯。推測由于果蠅壽命周期過短,尚不能模擬人類機體隨節氣更迭而產生的變化,故不能體現中醫按照節令給藥的科學性。

3.4 爬行實驗與冷應激實驗的作用

機體運動能力和冷應激能力是衰老的兩個指標，本研究采用攀附指數評價龜齡集對果蠅機能的影響。龜齡集對40日齡果蠅的運動能力無明顯提高作用，推測可能果蠅在40日齡時由于機體的衰老，龜齡集只能有限地提高果蠅的運動能力。而且本研究還通過測定40日齡果蠅在冷刺激下的攀附指數評價龜齡集對果蠅抗冷應激能力的影響，實驗結果表明龜齡集可提高果蠅的抗冷應激能力。

綜上所述,龜齡集可延長果蠅壽命,龜齡集的最佳給藥方式為在果蠅30日齡時給藥,連續15 d后停藥。龜齡集可改善果蠅抗冷應激能力,龜齡集確實具有延緩衰老藥效。在后期研究中可采集各年齡段的生物樣本使用代謝組學技術、網絡藥理學等新技術,增加抗氧化酶活力的測定等其他指標輔助驗證龜齡集延緩衰老的作用,進一步探討龜齡集抗衰老機制。