尿酸對急性發作期痛風患者外周血中性粒細胞胞外誘捕網形成的影響及其臨床意義

滿達夫,侯云霞,李鴻斌

(內蒙古醫科大學附屬醫院風濕免疫科,呼和浩特 010050;*通訊作者,E-mail:lhbwb73@126.com)

痛風是由嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄障礙所致的一組異質性疾病,是由于單鈉尿酸鹽(monosodium urate,MSU)結晶在關節和軟組織中積聚所致,其臨床表現包括無癥狀高尿酸血癥、急性痛風性關節炎、痛風石、慢性痛風性關節炎、尿酸性腎病和尿路尿酸鹽結石等[1]。除關節損傷外,痛風患者還可合并心血管和腎臟疾病[2]。目前我國痛風的患病率在1%-3%,并呈逐年上升趨勢[3,4]。盡管多數痛風患者關節炎癥狀會在2周內自愈,但其治療不充分、患者依從性差是痛風管理的主要挑戰。近年來國內外研究發現,血尿酸濃度增高形成高尿酸血癥、尿酸沉積后形成的MSU可刺激單核巨噬細胞活化和多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)活化脫顆粒引發局部炎癥反應,是痛風發作的關鍵因素[5]。事實上,PMN激活后可釋放由細胞質與顆粒的內容物及DNA組成的中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs),以消除細胞外病原體。從宿主-病原體的角度上考慮,NETs對宿主早期發揮抗感染免疫具有重要作用,然而研究表明中性粒細胞的過度活化可參與炎癥和自身免疫過程,包括類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡[6]。動物模型及體外實驗表明沉積于關節腔內的MSU可激活NETs的形成,從而誘發急性痛風性關節炎到痛風石形成的一系列病理機制[7]。但是,外周血的中性粒細胞是否能在MSU誘導下激活NETs形成,參與痛風的病情活動尚未見確切報道。本研究旨在探討MSU誘導的NETs水平是否與痛風的病情活動度和嚴重程度相關,即中性粒細胞對MSU的敏感性是否在急性痛風發作期與健康對照、緩解期之間存在差異。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入的所有研究對象來源于內蒙古醫科大學附屬醫院,其中健康對照(healthy control,HC)組來源于體檢中心25名成年男性健康志愿者,痛風(gout)組來源于風濕免疫科2017年1月至2018年1月期間住院及門診的56名痛風性關節炎急性發作期患者,同時痛風組患者經治療后1個月后處于緩解期(remission)作為疾病的陰性對照。納入標準:根據2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟痛風分類診斷標準[8](ACR-EULAR Gout Classification Criteria),≥8分符合痛風診斷,或1977年美國風濕病協會分類標準急性痛風關節炎的分類標準[9]。排除標準:入組患者需除外其他風濕病史、骨關節病、血栓相關疾病和近期感染史。痛風組患者在接受治療前完成外周靜脈血采集和臨床相關實驗室檢測,作為基線期數據。本研究通過內蒙古醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準(批準號:KY20163202-1),所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

Leica DMI4000 B智能型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司),BD FACSCalibur全自動雙激光四色流式細胞分析分選系統(美國BD公司),Sorvall ST 40R離心機、HeraeusTMFrescoTM21 Microcentrifuge、Heraeus Labofuge 400 R離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司),Bio Tek SNergy H4(美國伯騰儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 入組對象外周血中性粒細胞的分離 收取患者或健康對照的新鮮外周抗凝血5 ml,按照PolymorphprepTM密度梯度離心法分離人外周血中性粒細胞[10],吸取中性粒細胞層轉移至新的離心管中,加入10 ml HBSS,上下顛倒數次,懸浮細胞,室溫下400g離心10 min,棄上清。加入2 ml紅細胞裂解液重懸,上下吹打混勻,300g離心5 min,棄上清,加入RPMI-1640培養基,計數,調至1×106/ml后待測純度。

1.3.2 中性粒細胞純度的檢測 分別吸取10 μl細胞至3個潔凈的1.5 ml EP管,300g離心5 min,棄上清。每管均加入200 μl PBS重懸細胞,一管加入20 μl CD16單抗作為實驗組,另一管加入20 μl Mouse IgG1 kappa作為同型對照,最后一管則加入20 μl PBS作為空白對照。4 ℃避光孵育30 min,PBS洗滌2次,最后一次離心后加入200 μl PBS重懸細胞,上機分析,純度大于95%的中性粒細胞進行后續實驗。

1.3.3 體外誘導中性粒細胞形成NETs 24孔板中預先置入多聚賴氨酸處理的無菌玻璃片,按4×105個/孔接種上述實驗分離出的中性粒細胞,CO2培養箱中靜置培養細胞1 h。根據中性粒細胞來源不同,分為健康對照組(HC組)及痛風急性發作組分別加入等體積100 nmol/L佛波酯(PMA),125,250,500 μg/ml尿酸鹽(MSU)分別誘導細胞,空白對照組(PBS組)予等體積PBS;3 h后收集細胞上清,用于檢測游離cfDNA、NE濃度。

1.3.4 免疫熒光法檢測NETs形成 細胞爬片固定,用1%BSA封閉30 min,用抗H3Cit、抗MPO孵育1 h,PBS洗滌后用相應二抗避光孵育1 h,之后DAPI染核1 min,洗滌后封片在熒光顯微鏡下成像觀察。

1.3.6 病情評價指標 包括患者疼痛視覺模擬評分法[11](visual analogue scale,VAS)、痛風疾病評估問卷2.0版[12](gout assessment questionnaire,GAQ 2.0)及痛風疾病活動性評分[13](gout activity score,GAS)。

1.4 統計學處理

計數資料用頻數(百分數)表示,計量資料用均數±標準差表示,根據數據的分布特點兩組間的比較采用配對t檢驗(急性發作期和緩解期的相關數據)、獨立t檢驗或卡方檢驗。變量間相關性分析采用Pearson相關分析。統計軟件采用SPSS 19.0,以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的臨床特征

痛風急性發作組與健康對照組在年齡、性別、BMI、血糖和低密度脂蛋白之間的差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。痛風急性發作組甘油三酯和血清尿酸水平高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.01,見表1)。

表1 入組研究對象的臨床特征

2.2 中性粒細胞純度的鑒定

根據CD16標記中性粒細胞鑒定分離純度(見圖1),FITC-CD16單抗標記分離的中性粒細胞,流式細胞術檢測CD16陽性細胞純度可達97.08%(圖1紅色矩形標出)。

2.3 HC組與痛風組中性粒細胞誘導形成cfDNA濃度的比較

圖2為熒光顯微鏡NETs形成圖,中性粒細胞經PMA刺激后,細胞釋放至上清的cfDNA含量明顯升高。痛風急性發作期組中性粒細胞經125,250,500 μg/ml尿酸鹽誘導3 h,即可產生大量cfDNA,高于同一濃度下健康對照組(HC組)產生的cfDNA濃度,并且高于同一組內空白對照組(PBS組)的cfDNA濃度(P<0.01,見表2),該結果與免疫熒光染色結果一致(見圖3)。

圖1 流式細胞儀檢測中性粒細胞純度Figure 1 The purity of neutrophils detected by flow cytometry

A.免疫熒光顯微鏡評估NETs (×400)B.NETs形成細胞的百分比圖2 熒光顯微鏡鑒定NETs形成Figure 2 NETs formation identified by fluorescence microscopy

表2 痛風患者與健康對照細胞上清液cfDNA濃度的比較 (ng/ml)

圖3 痛風患者與健康對照中性粒細胞對不同誘導劑的反應Figure 3 Neutrophil response to various inducers in patients with gout and healthy controls

2.4 急性發作期痛風患者NETs水平與臨床特征的相關性分析

痛風急性發作期患者血漿中cfDNA和NE水平具有很強的正相關性(r=0.762,P<0.01)。痛風急性發作期患者血漿cfDNA和NE濃度與患者的年齡、BMI無相關性(P>0.05,見表3)。在患者的常規生化指標中,僅甘油三酯與cfDNA呈現出弱相關性(r=0.277,P<0.05)。血尿酸水平與cfDNA呈顯著強正相關性(r=0.612,P<0.01),與NE水平呈中等程度正相關性(r=0.564,P<0.01)。在3個病情評價指標中,GAS和GIS與患者的NETs水平呈現出明顯的強正相關性(r>0.6)。臨床中常用到非特異炎癥評價指標,血沉與NETs水平顯示出中等程度相關(r>0.4),C反應蛋白呈現弱相關(r>0.2)。以上結果的差異均具有顯著的統計學意義(P<0.05,見表3)。

2.5 急性發作期與發作緩解期NETs水平的差異

痛風急性發作期患者56例經相關治療后1月,收集其外周血,檢測cfDNA和NE水平,再次復查相關指標,構成前后對照。與急性發作期比較,緩解期除低密度脂蛋白外,各項指標均有顯著改善,甘油三酯、血尿酸水平、炎性指標、病情評價指標和循環NETs濃度明顯下降(P<0.05,見表4)。

為了進一步研究痛風患者血漿NETs水平與病情的相關性,我們對上述指標的變化值(Δ值)進行相關性分析。在SPSS軟件中,將每位患者急性發作期的單項數值減去緩解期的數值,定義為該患者該項指標的變化值(Δ值)。

表3 痛風急性發作期患者NETs水平與臨床指標的相關性分析

表4 急性發作期與發作緩解期臨床特征的比較

每項指標Δ值之間做Pearson相關分析,結果見表5。痛風病情評價指標中,△GAS與血漿NETs的變化(ΔDNA,ΔNE)顯示中等程度的正相關性(r>0.5,P<0.01)。ΔCRP與ΔESR未顯示出與病情評價指標變化值之間明確的相關性,但二者之間存在中等程度正相關性(r=0.565,P<0.01)。ΔsUA與ΔGAS之間存在中等程度正相關性(r=0.580,P<0.01)。

表5 觀測指標值的相關性分析

3 討論

研究表明,急性痛風性關節炎發作時,MSU晶體可誘導大量的炎癥細胞(包括中性粒細胞和單核細胞)募集、浸潤于晶體沉積部[10]。這些免疫細胞釋放的IL-1進一步激活促炎細胞因子和趨化因子的釋放,如IL-8、IL-6和CXCL8,上調內皮細胞表面的選擇素和整合素,進一步增強中性粒細胞的募集。此外,MSU晶體還可激活局部浸潤的PMNs,誘導其解離cfDNA,釋放NE、MPO及胞漿蛋白,形成NETs[14,15]。本研究通過MSU體外誘導NETs生成實驗證實痛風急性發作期患者的中性粒細胞對MSU的敏感性較健康對照、痛風緩解期患者的高,且NETs水平與疾病活動度、病情嚴重程度呈正相關性。

首先,通過比較痛風組和HC組的基線情況,發現兩組在一般情況(年齡、性別和BMI)與常規生化指標(血糖和低密度脂蛋白)的差異均無統計學意義,而痛風組的尿酸顯著高于HC組,表明兩組樣本具有代表性和可比性。其次,本研究利用目前國際上主流的、可靠的免疫熒光法鑒定NETs結構[16],在不同濃度梯度的MSU誘導下,痛風組的中性粒細胞較HC組產生更高濃度的cfDNA和NE,提示痛風急性發作期患者的中性粒細胞對MSU誘導產生的NETs更敏感[17]。結合臨床現象,部分患者的血尿酸水平持續性或波動性升高,但未發生痛風,從高尿酸血癥發展至痛風可長達數年至數十年,且有部分患者并不發生急性痛風性關節炎,稱為“無癥狀高尿酸血癥”[18]。根據本文的研究結果,可推測發生痛風患者的中性粒細胞可能在先天、后天因素的累積影響下發生缺陷,增加其對MSU的敏感性,誘導NETs的大量生成,從而導致痛風的急性發作[19]。這與既往研究結果一致[20],即體外MSU能誘導循環中性粒細胞NETs的形成。其具體機制目前尚未明確,一個假說認為關節局部的MSU小晶體可進入外周循環,活化中性粒細胞而導致NETs的形成[7];亦有可能局部炎癥觸發全身炎癥狀態,在沒有MSU直接刺激下啟動中性粒細胞的活化和NETs的形成。

另外,本研究發現痛風急性發作期患者外周血中NETs水平與病情活動度(GAS評分)和病情嚴重程度(GIS評分)呈正相關性,揭示NETs水平可用于痛風病情嚴重程度的評價。這符合NETs為廣義的致病性DNA復合物的定義,機體的炎癥狀態與NETs水平相關。然而Vedder等[21]發現cfDNA水平與痛風患者疾病活動或炎癥標志物無關,有可能與該研究對痛風病情活動和嚴重程度的評分工具與本研究不同,且該研究直接檢測的循環cfDNA而不是體外MSU誘導的cfDNA水平。

在對急性發作期組和緩解組的NETs分析時,可發現緩解組的非特異炎性指標、血尿酸水平、NETs水平、病情的活動性和嚴重程度均較急性發作期組明顯降低,提示目前的痛風急性期治療方案可有效控制病情,使疾病進入緩解期。在各項指標變化值(值)的相關性分析中,僅有GAS與GIS之間具有高度相關性(r>0.6,P<0.01),提示GAS和GIS評分較為穩定。而GAS與NETs之間具有中等程度的相關性(r>0.5,P<0.01),說明患者外周血NETs水平在評價疾病嚴重程度方面穩定性較好。

本研究具有一定的局限性。首先,本研究納入的研究對象均為男性,結果可能由性別帶來的差異而產生偏倚。其次,本實驗并未對高尿酸血癥患者和痛風患者之間的NETs水平差異進行深入研究。最后,由于本研究檢測的NETs指標(包括cfDNA和NE)均為體外MSU誘導下進行,未能闡釋機體真實的循環NETs水平,對未來的臨床應用仍需更多的研究支持。