染色體微陣列技術對1例6p21微缺失綜合征的產前診斷

萬陜寧,黨穎慧,鄭蕓蕓,宋婷婷,張建芳,李 佳,楊 紅

(空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghonhfck@163.com)

6p21微缺失綜合征也稱顱骨鎖骨發育不良綜合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一種罕見的常染色體顯性遺傳的骨骼發育不良綜合征,主要臨床特征是前額和頂葉突出、短頭畸形、顱縫閉合較晚、發育不全或鎖骨再生不全、多種牙齒異常和身材矮小等。染色體微陣列分析技術(chromosomal microarray-based analysis,CMA)可用于全基因組水平的拷貝數分析,不僅可以快速有效地檢測常規核型分析的染色體不平衡變異,而且可以檢測整個基因組的微缺失和微重復。與常規G顯帶核型分析相比,CMA具有高分辨率、高敏感性、快速準確、易于自動化等優點。本文報道1例聯合應用常規G顯帶核型分析和CMA技術進行檢測,發現6p21微缺失病例,并探討其臨床表現和發病機制。

1 病例資料

1.1 臨床資料

孕婦,33歲,G3P1A1,孕26周,生育過一個健康孩子,人工流產一次。孕婦平素月經規則,孕期順利,無特殊不適。無抽煙、嗜酒史,無胎兒畸形家族史。否認近親結婚,否認輔助生殖。孕早期B超提示胎兒頸后透明層(NT)值1.6 mm,無創DNA檢測結果為低風險。因孕中期B超提示胎兒顱骨欠規則,顱骨部分回聲減弱,顱內腦回,腦溝減少,變淺,胎兒鼻骨顯示不清,來本科室就診。

1.2 檢測方法

1.2.1 G顯帶核型分析 超聲下進行羊膜腔穿刺術抽取孕婦羊水20 ml,取10 ml標本進行羊水細胞培養,按常規方法制片,G顯帶分析。顯微鏡下計數20個中期分裂相,分析5個細胞核型,對異常核型增加分析數,根據人類細胞遺傳學國際(ISCN2016)命名體制描述染色體異常核型。

1.2.2 CMA檢測 取10 ml羊水標本進行基因組DNA提取,使用QIAGEN公司生產的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒,嚴格按照試劑盒說明書進行。應用美國Affymetrix公司生產的Affymetrix CytoScan 750k基因芯片進行CMA檢測,實驗過程包括酶切、連接、PCR擴增、片段化、標記、芯片雜交、洗染和掃描。使用Chromosome Analysis Suite(ChAS; version2.1)軟件對芯片掃描的數據進行分析,參照數據庫DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、DGV(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu)、PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)等進行結果分析。檢測結果拷貝數變異CNV(Copy number variations)分為致病性CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV、可能良性CNV和良性CNV。

1.3 檢測結果

染色G顯帶結果顯示核型結果為46,XY(見圖1),核型無明顯異常。而CMA分析發現染色體6p21.1位置arr[hg19]6p21.1(44,032,138-45,486,795)x1發生1.45 Mb的缺失(見圖2),查詢數據庫發現該區域為致病性CNV,該區域位置包含了19個OMIM基因(見圖3),包括RUNX2(OMIM119600;600211),VEGFA(OMIM 192240),NFKBIE(OMIM 604548)等,其中綠色基因為致病基因。

2 討論

顱骨鎖骨發育不良綜合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一種罕見的骨骼疾病,屬于常染色體顯性遺傳,具有特征性的臨床表現。CCD是以顱面骨異常為主的全身各處骨骼系統廣泛受累的先天性骨發育疾病[1,2],其特異的臨床表現主要有:鎖骨缺如,或發育不全,顱部囟門張開和延遲閉合,牙齒萌出異常或多生牙;全身其他臨床特征還可表現為:面中部發育不足,圓錐狀胸廓,肩胛骨小,骨盆發育不全,恥骨聯合間隙增寬,身材矮小等。特殊臨床表現還涉及腦異常包括回腦小,胼胝缺如,結構錯亂以顳葉及小腦為著。胎兒期伴羊水過多等癥狀。

圖3 染色體6p21區域包含的基因(綠色為明確致病基因)

本例患者羊水穿刺核型分析結果正常,CMA檢測發現6p21位置發生1.45 Mb缺失,該區域包含19個OMIM基因,查閱數據庫DECIPHER、OMIM、DGV、UCSC后,分析發現該片段區域功能性基因的缺失可導致患者出現6p21缺失綜合征,即CCD。而孕婦孕中期B超提示顱骨欠規則,顱骨部分回聲減弱,顱內腦回、腦溝減少,變淺等癥狀與文獻報道[1,2]的CCD臨床表現相似。

通過檢索文獻發現基因RUNX2是CCD的主要致病基因,位于6號染色體短臂6p21,為主要的調控轉錄因子,控制著前體細胞向成骨細胞的分化,是膜性和軟骨內骨形成的關鍵[3]。它被稱為骨骼發育的主基因[4]。在報道的CCD病例中,大約60%-70%的病例存在RUNX2突變,約13%的病例存在涉及RUNX2和相鄰基因的微缺失[5],至少有62種RUNX2突變已經在CCD患者中被發現[6,7]。RUNX2基因是RUNX轉錄因子家族的一員,編碼具有Runt結構域的核蛋白,該蛋白是成骨細胞分化和骨骼形態發生所必需的,并作為骨架基因表達所涉及的核酸和調控因子的支架。這種蛋白質既可以作為單體結合DNA,也可以作為異二聚體復合物的亞基結合DNA(親和力更強)。編碼蛋白的N端區域存在兩個潛在的三核苷酸重復擴增區域,該基因中的這些和其他突變都與骨發育障礙有關。因此,CCD的特點是全身骨骼發育不良,尤其是異常的鎖骨、未閉合的顱骨縫合線和骨間窩、多余的牙齒、矮小的身材以及其他各種骨骼變化。阿根廷的一份報告稱,在對37例病例研究中,發現95%有顱骨異常,75%有單鎖骨改變,100%有雙側鎖骨改變[8]。

此外,6p21上除RUNX2以外的基因的單倍體不充分也可能是造成發育遲緩和傷口愈合不良的表型[9]。基因VEGFA(OMIM 192240),位于6p21,編碼血管內皮生長因子A(VEGFA),它是血管內皮細胞的血管生成調節因子,VEGFA刺激上皮細胞的增殖、血管的形成和內皮細胞的存活。缺乏VEGFA可能導致血管生成不良和血管外重構,從而影響傷口愈合。基因NFKBIE(OMIM 604548),位于6p21,編碼NF-kappa-B抑制劑,NFKBIE的缺乏可能導致感染和炎癥的易感性,并導致傷口愈合不良[10]。因此,幼兒期的患兒由于骨化缺陷,頭部外傷后易發生腦損傷,傷口愈合不良等情況,如有需要,可提供防護頭盔,隨時觀察孩子的生長發育情況,進行相應的保護措施[11]。

綜上所述,我們對1例孕中期B超提示異常的孕婦進行了產前診斷,胎兒的診斷結果為顱骨鎖骨發育不良綜合征,對本例孕婦夫妻雙方進行CMA檢測驗證,發現胎兒的缺失為新發的,而且孕后期B超提示CCD癥狀明顯,此家庭最終選擇終止妊娠。我們對CCD的臨床表現及發病機制進行了分析,為此類疾病的遺傳咨詢提供了依據,也有助于對癥狀輕微的胎兒出生后的表型進行初步估計,對于患兒及其后的治療和隨訪有重要的意義。對于傳統細胞遺傳學檢測方法而言,CMA是一個很好的完善和補充,尤其是針對染色體微缺失或微重復的產前診斷病例,染色體微陣列分析技術的優越性得到體現。對于臨床表現特殊,常規G顯帶核型分析未見異常的患者,更應建議進一步的CMA檢測。