彩色油菜花瓣色素成分研究

柳 寒 任 韻 林寶剛 朱建方 程 輝 張冬青 王軍威 華水金

(1浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021；2湖州市農業科學研究院，浙江 湖州 313000；3信陽市農業科學院，河南 信陽 464000)

油菜(Brassica napusL.)是我國重要的油料作物。油菜除榨油外，還具有蔬用、觀賞用、飼用、蜜用、鹽堿地改良、肥用和藥用等功能[1-2]。油菜作為觀賞用或者觀賞-油料兩用的歷史悠久，且具有獨特的優勢，如浙江仙居和江西婺源的梯田油菜花海[3-4]，以花為媒，打造美麗鄉村，促進三產融合潛力極大。傳統油菜花為黃色系，如奶黃、土黃、深黃等。之后通過育種培育出白色、橙色、紅色和紫色等色系的彩色油菜花。白色系主要有純白、乳白、翠綠。黃色和白色系育成較早，而且色系穩定，在生產上已有較大面積的推廣與應用[4]。橙色系、紅色系和紫色系顏色豐富，但是生產上色澤穩定。

雖然彩色油菜已廣泛應用于創意農業，但是，關于不同色系彩色油菜色素形成機理鮮有報道。橙色和紅色系是近年來新育成的彩色油菜類型，具有極高的觀賞價值。然而，這些彩色油菜花瓣中積累的色素尚未知曉。推測彩色油菜花瓣中可能含有花青素或能夠呈色的次生代謝化合物。植株中花青素的合成途徑已經較為明確，且在部分物種中進行了詳細的研究[5-7]。花青素屬于黃酮類化合物，其合成分三個階段:第一階段以苯丙氨酸為底物合成4-香豆酰CoA；第二階段由4-香豆酰CoA 和丙二酰CoA 在一系列酶促反應下合成二氫黃酮醇；第三階段由二氫黃酮醇在二氫黃酮還原酶(dihydroflavonol reductase，DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)等酶作用下合成各種花青素，如芍藥素、矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素等[8-10]。最后在合適的pH 值和轉錄因子調控等作用下呈色[11-13]。目前，對于彩色油菜花瓣色素的種類、成分及相應的代謝途徑調控、相關酶類活性、編碼基因表達情況等問題需要進一步探索。本研究采用紅色、橙色、黃色和白色4 種色系彩色油菜為材料，首先對彩色油菜花瓣中與色素積累有關的花色素次生代謝產物進行測定，然后采用液質聯用儀對類胡蘿卜素和花青素進行組分鑒定和定量分析，同時分析花青素合成過程中關鍵酶活性，最后從基因表達水平探究油菜花瓣色素積累的特征，旨在為彩色油菜育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為花瓣顏色穩定遺傳的紅色、肉紅色、肉橙色、橙黃色、橙色、深黃色、土黃色、翠綠、白色和黃色(常規顏色)共10 種彩色油菜品系(圖1)，由浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所油菜育種與栽培研究室選育和提供，常規黃色油菜品種為浙油51。

1.2 試驗設計

試驗于2018—2019年在浙江省杭州市余杭區良渚麟海蔬果專業合作社基地進行。以9 個品系材料為處理組，以常規黃色品種(浙油51)為對照組。2018年10月7日直播(穴播)，每穴約5 粒種子。播種3 d后灌溉1 次跑馬水(傍晚灌溉，邊灌邊排，水溝水面低于畦面，保持12 h)。待油菜出苗后，立即用70%噁霉靈可濕性粉劑(3.5 g·L-1)噴施，以防治油菜猝倒病和立枯病等病害。11月1日間苗，11月15日定苗，使油菜群體密度達到每公頃300 000 株，株距與行距分別為10 和30 cm，小區面積13 m2。采用油菜專用肥(湖北宜施壯農業科技有限公司，N-P2O3-K2O:25-7-8)作為底肥，施用量為750 kg·hm-2；其他時期不灌水，病蟲害和田間管理按照常規栽培管理方式進行。

1.3 取樣與檢測

1.3.1 取樣 當油菜進入盛花期，75%以上植株開花后開始取樣，只選取主花序開5 朵花以內、花蕾飽滿的主花序花蕾，每小區隨機選取150～200 個花蕾。將開過的花朵丟棄，選擇尚未開放的花骨朵，用鑷子剝去花苞，取下花瓣，分裝于2 mL 離心管，用液氮冷凍后-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.2 黃酮類和類胡蘿卜素次生代謝物含量檢測取烘干花瓣100 mg，用15 mL 70%乙醇洗入棕色離心管中，30℃超聲30 min，冷卻至室溫，10 000×g離心5 min，上清液洗入棕色容量瓶中；殘渣用15 mL 70%乙醇重復提取1 次，合并兩次上清液，以沒食子酸和單寧為標準品，Folin-Ciocalteu 法[14]測定總酚和單寧含量。取100 mg 冷凍鮮花瓣，液氮中粉碎，用5 mL 80%丙酮提取，室溫下超聲波提取30 min，10 000×g離心5 min，上清液洗入容量瓶中；殘渣用5 mL 80%丙酮重復提取1 次，合并兩次上清液，以表兒茶素為標準品，香草醛比色法[15]測定原花青素含量。取烘干花瓣100 mg，粉碎，用10 mL 70%乙醇于70℃下水浴回流1 h 后，抽濾，濾液用70%乙醇定容至50 mL，以蘆丁為標準樣品，采用亞硝酸鹽-氯化鋁法測定類黃酮含量[16]。取烘干花瓣100 mg，粉碎，用1%鹽酸乙醇溶液5 mL 于4℃浸提24 h，8 000×g離心10 min，取上清液，重復提取3 次，上清液合并后減壓蒸干，并用10 mL 甲醇溶液定容，用pH 示差法[17]測定花色苷含量。

根據花色苷測定結果，采用液質聯用儀(1290 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Qtrap6500 質譜儀，美國AB 公司)進一步對紅色、黃色和橙色油菜花瓣中的4 種主要花青素成分進行定量(矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素和芍藥素)。4 種花青素標準品購自美國Sigma 公司。液相條件:poroshell 120 SB-C18 反相色譜柱(2.1 mm×150 mm×2.7 μm，美國安捷倫公司)，流動相為甲醇(含0.1%甲酸)∶水(0.1%甲酸)。質譜條件:氣簾氣15 psi，噴霧電壓4 500 V，霧化氣壓力65 psi，輔助氣壓力70 psi，霧化溫度400℃。

紅色、橙色、黃色和白色油菜花瓣采用高效液相色譜法測定類胡蘿卜素組分；包括α-，β-胡蘿卜素和番茄紅素(標準品購自美國Sigma 公司)，液相條件:色譜柱，Waters Symmetry Shield RP18 反相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶三氯甲烷=20∶75∶5(體積比)。

1.3.3 花青素合成相關酶活性檢測 紅色、白色、翠綠和黃色4 種彩色油菜花青素還原酶(anthoayanidin reductase，AVR)、DFR 活性采用比色法測定，ANS 活性采用ELISA 法測定，采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒檢測，具體操作按照說明書進行。

1.3.4 花青素合成關鍵酶基因qRT-PCR 檢測 以紅色、橙色、橙黃色、黃色、土黃色、深黃色、白色和翠綠色油菜為材料。取-80℃超低溫冰箱保存的花瓣用于提取RNA，RNA 提取試劑盒為QIGEN RNeasy Plant Mini kit(Qiagen 74903，德國)。提取的RNA 經反轉錄合成cDNA 備用。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(RR407A)反轉錄試劑盒(北京TaKaRa 公司)進行反轉錄。選擇查爾酮合成酶基因(chalcone synthase，CHS)，查爾酮異構酶基因(chalcone isomerase，CHI)，黃烷酮3-羥基化酶基因(flavanone 3-hydroxylase，F3H)，類黃酮3’-羥化酶基因(flavanoid 3-hydroxylase，F3’H)，二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)和花青素合成酶基因(ANS)，進行表達量分析。采用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)對花青素合成關鍵酶基因表達檢測時，以油菜ACTIN作為參考基因。所選擇的基因首先與相對應的擬南芥基因比對，然后在油菜基因組數據庫中搜尋對應基因 (http:/ /www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)。qRT-PCR 所使用的引物見表1。qRT-PCR 分析采用羅氏LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀(Roche，瑞士)。檢測方法如下:將反應混合物(2×)、反轉錄cDNA、基因特異引物(表1)依次加入反應板，用無RNase 蒸餾水補足至20 μL，均勻混合后上機檢測。反應程序:95℃30 s 循環1 次；95℃5 s，60℃45 s，循環35 次。

表1 編碼油菜花青合成關鍵酶基因qRT-PCR 的引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR for genes encoding key enzymes in Anthocyanin

1.4 統計分析

采用2-ΔΔCt法計算基因表達量，結果以黃色油菜花瓣中的表達量為對照加以表征(即以黃色油菜花瓣中基因表達量為1，其余花色油菜花瓣中的表達量為相對于黃色油菜花瓣表達量的倍數)。試驗測定的各指標平均值采用單因素方差分析，各平均值之間的差異采用Duncan’s 法分析。彩色油菜花瓣中花色苷含量與DFR和ANS基因的表達量進行Person’s 相關性分析，并進行顯著檢驗。數據統計分析采用R3.6.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 彩色油菜花瓣次生代謝物含量比較

由表2可知，各色系油菜花瓣中含有豐富的酚類物質，其含量介于8.87(深黃)～16.79(紅色)mg·g-1DW 之間；紅色系和橙色系油菜花瓣中的總酚含量無顯著差異，但顯著高于黃色、深黃色和白色油菜。黃色油菜花瓣中的單寧含量最低，僅為含量最高的肉紅色油菜58.0%。彩色油菜中的原花青素僅在紅色系和橙色系油菜花瓣中檢測到，且橙色和紅色油菜花瓣中的原花青素含量顯著高于其衍生色系(肉紅、肉橙和橙黃)。同時，紅色和橙色油菜花瓣中的原花青素含量分別占單寧類化合物的85.5%和84.1%，說明紅色和橙色油菜花瓣中的單寧類化合物主要成分是原花青素。橙色油菜花瓣中積累的類黃酮最多，而黃色油菜花瓣中的類黃酮含量最低，僅為橙色油菜花瓣中的45.4%。紅色系和橙色系(除橙黃)油菜花瓣含有大量的花色苷，橙色油菜花瓣中的花色苷含量是黃色、土黃和深黃油菜花瓣中的5.8、25.0 和27.3 倍。雖然紅色系和橙色系花瓣中的花色苷含量很高，但只占類黃酮物質的5.4%～10.2%。因此，相比于常規的黃色系以及選育的白色系油菜，紅色系和橙色系油菜花瓣中含有更多的酚類和黃酮類次生代謝產物。

表2 彩色油菜花瓣色素代謝次生代謝物含量Table 2 Contents of pigment secondary metabolites in the petal of colored rapeseed lines

2.2 彩色油菜花瓣類胡蘿卜素和花青素組分定量分析

為了進一步明確彩色油菜花瓣中的色素成分，對有可能呈色的類胡蘿卜和花青素兩種成分進行了定量分析(表3)。結果表明，三種類胡蘿卜素成分在彩色油菜花瓣中的趨勢與黃酮類次生代謝產物一致，即橙花＞紅花＞白花＞黃花。就三種類胡蘿卜素成分而言，番茄紅素含量最高，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量在紅色和橙色油菜花瓣中基本一致。黃色油菜花瓣以α-胡蘿卜素為主，是β-胡蘿卜素含量的6 倍；白花油菜則相反，β-胡蘿卜素是α-胡蘿卜素的1.6 倍。

表3 彩色油菜類胡蘿卜素和花青素成分Table 3 Content of components of carotenoids and anthocyanins in colored rapeseed lines

紅色油菜花瓣的主要花青素成分為矢車菊素，芍藥素和天竺葵素含量較少。紅色油菜花瓣中的矢車菊素分別是芍藥素和天竺葵素的21.5 倍和13.5 倍。而橙色油菜花瓣的主要成為芍藥素，含有少量矢車菊素和飛燕草素，其芍藥素分別是矢車菊素和飛燕草素的16.3 倍和79.3 倍。黃色油菜花瓣以矢車菊素為主，含少量天竺葵素和飛燕草素，芍藥素未檢測到。紅色油菜花瓣中的矢車菊素是橙色和黃色油菜花瓣的7.5倍和1.8 倍，而橙色油菜花瓣中芍藥素是紅色油菜花瓣的46.7 倍。由此可見，紅色與橙色、黃色油菜花瓣中的花青素組分不同。

2.3 彩色油菜花瓣花青素合成酶關鍵酶活性比較

比較花青素生物合成途徑中的關鍵酶活性發現(表4)，4 種彩色油菜中ANR、DFR 和ANS 活性均未存在顯著差異(P＞0.05)。ANR 活性在不同顏色油菜花瓣中的強弱依次為紅色＞橙色＞黃色＞白色，紅色油菜花瓣中的ANR 活性比白色油菜增加了9.4%。DFR活性在不同顏色油菜花瓣中的強弱依次為白色＞紅色＞橙色＞黃色，白色油菜花瓣中DFR 活性比黃色油菜增加了18.2%。ANS 活性在黃色油菜花瓣中最強，白色油菜花瓣中最弱。黃色油菜花瓣中的ANS 活性是白色油菜花瓣的1.5 倍。

表4 彩色油菜花瓣ANR、DFR 和ANS 活性比較Table 4 Comparison on the activity of ANR，DFR，and ANS in colored rapeseed lines

2.4 彩色油菜花瓣中花青素合成酶關鍵基因表達量

由表5可知，編碼花青素合成關鍵酶基因的表達量差異主要集中在DFR和ANS，即后期花青素合成的關鍵酶，且這兩個基因在紅色、橙色和橙黃色油菜花瓣中表達量較高，其中ANS基因的表達量是黃色油菜花的1 000 倍以上，而DFR基因則是黃色油菜花瓣中的表達量油菜花的100 倍以上。編碼花青素合成前期關鍵酶基因在紅花和白色油菜花瓣中表達量有顯著差異，但總體表達量比較弱，彩色油菜花瓣中的表達量僅為黃色油菜花瓣中表達量的0.39～2.34 倍，且大部分低于2 倍。以上結果說明彩色油菜花瓣色素的積累在基因表達水平上主要在于后期花青素的合成。

表5 彩色油菜花瓣花青素代謝關鍵基因表達量分析Table 5 Expression analysis of key genes in the anthocyanin biosynthesis in colored rapeseed lines

2.5 花青素合成與基因表達量的相關性分析

由表6可知，ANS和DFR的表達量與彩色油菜花瓣的花色苷含量呈正相關。ANS表達量與花色苷含量的相關性達到0.69，但不顯著，而DFR的表達量與花色苷含量顯著相關，相關系數達0.80。ANS基因和DFR基因的表達量極顯著相關，以上結果說明隨著花瓣顏色從白色、黃色向橙色、紅色轉化，花色苷的積累與花青素合成關鍵基因ANS和DFR密切相關。

3 討論

彩色油菜作為賞-油兼用型經濟作物在油菜種植區域具有較大的應用潛力，如長江流域冬油菜區和甘肅、青海、內蒙等春油菜區。近期，部分研究者新育成了紅色系、橙色系和紫色系等多種色系的彩色油菜，突破了彩色油菜花瓣色彩只有黃色系和白色系的限制，加快了彩色油菜在生產上的進一步應用。

表6 DFR、ANS 平均表達量和花色苷含量相關性分析Table 6 Correlation analysis among the expression level of DFR，ANS and anthocyains content

目前鮮有關于油菜花瓣色素方面的研究報道。曾德志等[18]對白花、黃色深淺程度不同的油菜花瓣中類胡蘿卜素成分進行分析，發現常規黃色油菜花瓣積累大量類胡蘿卜素，其成分以番茄紅素為主。因此，番茄紅素可能是影響黃色油菜花瓣色素的主要因素。然而，該結果是基于白色和黃色系油菜花瓣的色素成分研究而得出，未涉及橙色系和紅色系油菜。田間觀察發現，黃色系中的常規黃色、土黃和深黃色花瓣顏色穩定，花瓣白色和翠綠在一定程度上會發生轉化，但紅色和橙色系油菜花瓣中的顏色容易褪色(圖3)，說明紅色和橙色花瓣中的色素成分可能與黃色系不同，且具有花青素的特征。基于此，本研究對紅色系、橙色系、黃色系和白色系油菜花瓣中的色素成分、催化色素合成關鍵酶活性和編碼色素合成關鍵酶活性基因的表達量進行了系統分析和比較。

植物花瓣能夠呈色的次生代謝物質種類較多，如單寧類的原花青素是許多水果表皮(如葡萄)等呈色的主要化合物之一[19-21]。本研究中，盡管各色系花瓣中能夠積累大量的酚類物質，但單寧類化合物含量較少，而且與細胞呈色有關的原花青素在黃色系和白色系中未檢測到，說明這兩種色系花瓣中不合成原花青素。因此，在黃色和白色系油菜花瓣中以積累原花青素途徑顯現紅色至紫色的可能性較低。相反，紅色油菜的花瓣中原花青素含量非常高，總量超過了1 000 μg·g-1FW，說明紅色和橙色油菜花瓣顯色的色素可能為原花青素和花青素的混合色素；而橙黃色油菜則以花青素為主。介于紅色和橙色的衍生系油菜花瓣的呈色代謝與紅色和橙色發生了一定程度的改變，主要表現為這些衍生系花瓣中的原花青素含量降低；花色苷含量則有升有降。這可能是由于紅色和橙色與黃色和白色油菜雜交過程中，滲入了與花色素代謝相關的基因所致，其具體機理還需要結合遺傳學手段加以驗證。除了酚類物質，彩色油菜花瓣中還積累了大量的類黃酮色素，一部分用于花瓣顯色，可吸引昆蟲，助其授粉[22-23]；一部分則可能合成香氣，釋放強烈的特殊香味[24-25]；還有一部分黃酮類物質作為抵御外界病蟲的侵害和逆境而起作用[26-27]。本研究中檢測到的花色苷含量占類黃酮含量并不高，說明在油菜花瓣中用于呈黃色和白色之外顏色的色素物質僅占一小部分。

通過液質聯用儀進一步檢測發現紅色和橙色油菜花瓣中的花青素成分并不一致。紅花油菜以矢車菊素為主，而橙色油菜以芍藥素為主。不同的色素成分可能是導致紅色和橙黃色油菜花瓣最終呈色不同的重要原因。矢車菊素是許多果實如桑葚，藍莓、櫻桃等果實的主要色素成分，其顏色多為紅色[28]。而芍藥素在pH 值3.0 時，呈現強烈的橙紅色，但pH 值不是呈色的唯一條件[29]。此外，本研究對花瓣可能呈紅色的類胡蘿卜素成分也進行了檢測，結果顯示番茄紅素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量均很低。紅色油菜花瓣中的矢車菊素和橙色油菜花瓣中的芍藥素是番茄紅素的300 倍和700 倍以上，因此，推斷紅色和橙色油菜花瓣呈色過程中，類胡蘿卜素所起作用較小。在黃色油菜花瓣中各種類胡蘿卜素含量也不高，這與前人研究結果并不一致[18]，可能是取樣時期不一致造成的。值得注意的是，前人研究認為黃色油菜花瓣呈現黃色的主要色素為番茄紅素，其含量最高達到200 μg·g-1FW[20]，或者類胡蘿卜素總量，最高為700 μg·g-1FW 左右，本研究中，黃色油菜花瓣中檢測到較高含量的矢車菊素，與其他花瓣中含有一定量的花色苷一致(＞500 μg·g-1DW)，但花瓣仍然是黃色。其未能呈其他色彩的原因可能與黃色花瓣和紅色或橙色花瓣的呈色環境和調控機理不相同有關，如花瓣細胞中的pH 值、金屬離子種類和數量等[30]。黃色油菜花瓣呈現黃色可能是大量類黃酮物質積累和某些類胡蘿卜素成分共同作用所致。由于白色油菜花瓣中原花青素和花色苷等顯色物質均未檢測到，因此，其花瓣中的酚類和類黃酮物質的主要作用可能不是使花瓣顯色。張豹[31]采用圖位克隆技術，克隆到控制白色油菜花瓣色素形成的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因，進一步證實了白色油菜花瓣色素很有可能不是原花青素和花青素。

為了進一步了解紅色和橙色油菜花瓣中花青素的呈色機理，對花青素合成的關鍵酶活性和編碼這些關鍵酶類基因的表達進行了研究。紅色和橙色油菜花瓣中DFR和ANS表達量非常高，與花青素含量相關。然而，花青素合成途徑過程的早中期基因如CHS、CH1、F3H等表達量在紅色、白色等油菜花瓣中很低，因此推斷，紅色和橙色系油菜花瓣花青素積累的差異發生在后期催化花青素的合成步驟上。這與前人研究結果一致。Fu 等[32]通過轉入OvPAP2 基因，導致黃色油菜花瓣部分顯現紅色，且誘導DFR和ANS基因的表達量劇增。紫色甘薯薯塊在花青素大量積累階段，DFR基因表達也隨之上調[33]。本研究在檢測花青素合成的關鍵酶DFR 和ANS 活性時發現，各色系油菜花瓣中的差異不顯著，其與基因表達不一致的可能原因較多，如DFR 和ANS 基因合成酶的過程中受到磷酸的調控，導致酶活性在不同花色油菜花瓣中無顯著差異[34]。

本研究雖然明確了紅色系和橙色系油菜花瓣中的主要花青素成分，但因涉及到呈色的復雜性，有必要通過生物技術手段，如RNAi、基因組編輯，將花青素合成關鍵基因敲除，進一步明確彩色花瓣的呈色機理，為彩色油菜育種提供理論依據。

4 結論

本研究通過對彩色油菜花瓣色素成分的分析，明確了彩色油菜花瓣中含有豐富的酚類物質和黃酮類物質。紅色和橙色油菜花瓣含有大量的原花青素和花色苷；紅色和橙色油菜衍生系花瓣中則主要以花色苷為主。白色系油菜花瓣中不含原花青素和花色苷，黃色系油菜花瓣中也不含原花青素，但含有少量的花色苷。各色系油菜花瓣中的類胡蘿卜素以番茄紅素為主，但其含量很低。紅色油菜花瓣的花青素主要成分為矢車菊素，而橙黃色和黃色油菜花瓣中的花青素主要成分為芍藥素。紅色和橙色油菜花花青素合成過程中，DFR和ANS表達量激增，分別是黃色油菜花的1 000倍和100 倍以上，表明紅色和橙色油菜花瓣與花青素的合成有密切關系。本研究為彩色油菜采用基因改良油菜花色和育種提供了理論依據。