人參黃連有效組分速崩片的質量標準研究

高 旭，呂金朋，張 輝*，李晶峰*

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，長春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，長春 130117）

中醫學將糖尿病稱為消渴，臨床主要表現為多飲、多食、多尿、形體消瘦或尿有甜味。人參黃連有效組分速崩片由黃連總堿、人參總皂苷配伍，主要針對早期糖尿病腎病患者，其配伍充分顯示了中醫辨證施治與整體觀念的思想[1]。為了更好地控制該藥品的質量，本研究參照藥典和相關文獻資料，采用高效液相色譜法（HPLC）對人參黃連有效組分進行定性與定量檢測。

1 材料與儀器

1.1 試藥

人參黃連有效組分速崩片（批號：ZT191201、ZT191202、ZT191203）， 黃 連 總 堿（20181101、20181104、20181107），人參總皂苷（20181102、20181108、20181115）， 人 參 皂 苷Rg1（110703-201733）、Re（110703-201728）、Rb1（110704-201726）、Rd（111818-201603）、S-Rg3（18101302）、 鹽 酸小檗堿（110713-201712，中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%）、鹽酸藥根堿（110733-201609，中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%），甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀；SPECORD 200 plus 紫外檢測器，德國耶拿分析儀器股份有限公司；PT104-55SY 十萬分之一天平，福州華志科學儀器有限公司；BSA124S-CW 萬分之一天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；液晶超聲波清洗器，昆山潔力美超聲儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 人參黃連有效組分速崩片人參皂苷的含量測定研究

2.1.1 測定依據 參照《中國藥典》（2015 版）[2]人參含量測定項下選用的檢測波長，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號：Agilent Eclipse Plus-C18，4.6 mm×250 mm）；柱溫：30 ℃；以乙腈為流動相A，水為流動相B，按表1中洗脫表進行梯度洗脫；檢測波長203 nm，流速為1.0 mL·mL-1。

2.1.2 對照品溶液的制備 按表2 所示分別精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 標準品，加入適量甲醇配成下表所示濃度的人參總皂苷混合標準品溶液。

2.1.3 供試品溶液的備 取人參黃連有效組分速崩片10 片，研磨，精密稱取1 g，加甲醇30 mL 超聲30 min，過濾，取續濾液，水浴蒸干，加30 mL 水使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3 次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10 mL 使溶解，大孔吸附樹脂上樣，待樣品液面與大孔樹脂相水平后，加入70%乙醇100 mL洗脫，續濾液蒸干，30 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。

表1 流動相洗脫表

表2 人參皂苷混合標品統計表

2.1.4 方法學考察2.1.4.1 線性關系考察 分別以進樣量為2、4、6、8、10、12 μL 的混合對照品溶液注入液相色譜儀中，以進樣量（μL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的標準曲線，各對照品的回歸方程及線性范圍為：Rg1：Y = 203.09X + 13.234（1.08 ～6.48 μg）；Re：Y = 135.76X+62.095（1.09 ～6.54 μg）；Rb1：Y = 72.308X + 5.6685（1.14 ～6.84 μg）；Rd：Y =162.28X + 10.071（1.28 ～7.68 μg）；S-Rg3：Y =197.36X + 19.989（1.06 ～6.36 μg）[3]，見表3。

表3 線性考察數據（峰面積）

2.1.4.2 精密度試驗 精密吸取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的混標對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6 次，依2.1.1 方法測定，記錄峰面積積分值，計算，考察精密度，見表4。

精密度考察結果顯示：對照品溶液連續測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的混標對照品的峰面積結果的RSD 均＜2%，表明儀器、方法的精密度良好[4]。

表4 精密度試驗實驗結果（峰面積）

2.1.4.3 穩定性試驗 精密吸取同一人參總皂苷供試品溶液5 μL，按0 h、4 h、8 h、16 h、18、24 h分別注入液相色譜儀，依2.1.1 方法測定。以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的峰面積測定結果為指標，測定其在24 h 內檢測的穩定性，見表5。

表5 穩定性試驗結果（峰面積）

穩定性考察結果顯示：在24 h 內測定供試品溶液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的各標準品的峰面積的RSD 均＜2%，表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 5個基準物24 h內測定結果可靠，穩定性良好。

2.1.4.4 重現性試驗 精密量取同一人參總皂苷供試品共5 份，按供試品溶液項下制備方法制備，精密吸取5 μL，依2.1.1 方法測定，計算樣品含量，以考察本法的重現性[5]，見表6。

表6 重現性試驗（峰面積）

以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 為含量測定指標，考察本法的重現性，結果RSD 均＜2%，表明該方法重現性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 取3 批次已知含量的人參黃連有效組分速崩片10 片，研磨后精密稱定0.5 g，準確加人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和S-Rg3適量混合標準品溶液，按2.1.3 方法制備樣品溶液，每批樣品均平行進樣3 次，分別按這5 種人參皂苷的含量分別為80%、100%、120%的比例分別加入一定量的各人參皂苷標準品溶液，依2.1.1 方法測定，測定并計算各成分的加樣回收率及RSD 值[6]。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的加樣回收率分別為 101.5%、100.03%、99.02%、101.5%、100.02%，RSD 值分別為1.2%、1.02%、1.30%、0.86%、1.20%表明該方法的準確度良好，結果可信。

2.1.5 3 批樣品含量 根據外標公式計人參總皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的含量。樣品含量由樣品峰面積（A 樣）、對照品濃度（C 標）、對照品進樣量（Ⅴ標）三者的乘積比對照品峰面積（A 標）、樣品濃度（C 樣）、樣品進樣量（Ⅴ樣）三者的乘積求得。取不同3 批次人參黃連有效組分速崩片，每批次中均平行檢測3 個樣品，色譜圖見圖1、圖2。取平均值后，暫定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和S-Rg3 含量每片分別為2.92 mg、7.69 mg 、1.06 mg、4.42 mg 和0.56 mg。

圖1 人參皂苷混合對照品色譜圖

圖2 人參總皂苷色譜圖

2.2 人參黃連有效組分速崩片人參皂苷的含量測定研究

2.2.1 測定依據 參照《中國藥典》（2015 版）[2]黃連含量測定項下選用的檢測波長，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號：Xcharge- C18，5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：30 ℃以乙腈為流動相A，萬分之一三氟乙酸水為流動相B，按照表7 進行等度洗脫；檢測波長為345 nm。流速為0.6 mL·min-1。

表7 流動相洗脫表

2.2.2 對照品溶液制備 稱取鹽酸小檗堿1.88 mg、鹽酸藥根堿1.18 mg 溶于適量的甲醇中，混勻，分別得到濃度為0.47 mg·mL-1和0.295 mg·mL-1的鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿混合標準品溶液。

2.2.3 黃連供試品溶液制備 取10 片人參黃連有效組分速崩片，研磨，精確稱定1 g，加入25 mL 甲醇并超聲波30 min，過0.45 μm 濾膜，備用。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 紫外檢測波長確定 稱取適量的鹽酸小檗堿對照品，其相應的試劑作為空白，用紫外分光光度計（200 ～500 nm）進行全波長掃描，結果顯示，在345 nm 處有最大吸收峰，因此將345 nm 確定為檢測波長[7]。

2.2.4.2 線性關系考察 制備濃度分別為0.47、0.295 mg·mL-1鹽酸小檗堿及藥根堿的混合標準品溶液。進樣量分別為1、3、5、7、9、12 μL，注入液相色譜儀。進樣量（μL）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，分別繪制鹽酸小檗堿和藥根堿標準曲線，見表8。

表8 鹽酸小檗堿及藥根堿標準曲線數據（峰面積）

2.2.4.3 精密度試驗 精密吸取3 μL 鹽酸小檗堿和藥根堿的混合標準品溶液，將其注入液相色譜儀中，連續進樣6 次，依2.2.1 中方法測定，記錄峰面積積分值，考察精密度[8]，見表9。精密度考察結果顯示：對照品溶液連續測定鹽酸小檗堿和藥根堿的混標對照品的峰面積結果的RSD 均＜2%，表明該方法精密度良好。

表9 精密度實驗數據（峰面積）

2.2.4.4 穩定性試驗 精密吸取10 μL 同一黃連總生物堿樣品溶液，按一定時間分別注入液相色譜儀。依2.2.1 方法測定，以鹽酸小檗堿及藥根堿的混標對照品各成分的峰面積測定結果為指標，測定其在24 h 內檢測的穩定性[9]，見表10。

表10 穩定性實驗結果（峰面積）

2.2.4.5 重現性試驗 精密稱定5 份同一黃連總生物堿樣品，按供試品溶液項下制備方法制備樣品，精密吸取10 μL，按照方法2.2.1 進行測量，并計算樣品的含量，以研究該方法的重現性。見表11。

表11 重現性實驗結果（峰面積）

2.2.4.6 加樣回收率實驗 精密稱定已知含量的3批黃連總生物堿各2 mg，每批樣品平行進樣3 次，分別精密加入鹽酸小檗堿和藥根堿混合標準品溶液適量，每組分別按照鹽酸小檗堿和藥根堿總含量比例的80%，100%和120%，加入一定量的鹽酸小檗堿和藥根堿的標準品溶液，依2.2.1 方法測定，測定并計算各成分的加樣回收率及RSD 值。回收率由加入對照品后測得的含有該成分的量與加入對照品前測得的含有該成分的量的差值比加入對照品的量求得。

鹽酸小檗堿和藥根堿的加樣回收率分別為102.6%、99.6%和101.6%。RSD 值分別為101.3%，100.5%和99.6%。結果表明，該方法準確度高，結果可信。2.2.5 樣品測定 取3批人參黃連有效組分速崩片，每批檢測3 個平行樣品，色譜圖見圖3、圖4。取其平均值后，鹽酸麻風次堿和小堿的含量每片分別為2.644 mg 和39.02 mg。

圖3 混合對照品色譜圖

圖4 黃連總生物堿色譜圖

3 小結

人參在降糖方面有較好的活性，能夠加速糖尿病性大鼠血糖和血脂代謝，并促進胰島素分泌[10-11]，黃連可降低患者血糖、血脂[12-13]，人參黃連配伍后能夠改善糖代謝，并能維持胰島細胞身份[14]，且經課題組前期研究結果表明人參黃連配伍后表現的降糖活性優于單味藥。人參黃連有效組分速崩片具有使用劑量低、釋放速度快、作用靶點多等創新性，對糖尿病腎病的治療有重大意義[15]。本實驗通過高效液相色譜法檢測各成分的含量，操作簡單可靠，靈敏度高，初步建立該制劑的質量標準，為后續試驗研究提供理論基礎。