陸地棉GhBZR1 基因的克隆及功能研究

賀浪，張華崇，司寧，簡桂良*

（1.植物病蟲害生物學國家重點實驗室/ 中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193；2.黃岡市農業科學院，湖北 黃岡 438000）

棉花黃萎病，被稱為棉花的“癌癥”，是一種土傳維管束病害，由土傳真菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起。 該菌具有易變異、能產生微菌核和寄主范圍廣等特點[1]。 1935 年從美國引進斯字棉時，棉花黃萎病傳入我國并逐年擴散。 在許多國家，棉花黃萎病使植株發育不良、葉片萎蔫、維管束黃褐化、甚至死亡，造成的平均產量損失達10%～35%[2-3]。 目前沒有有效的殺菌劑防治棉花黃萎病，培育抗病品種是最可行的防治方法[4]。因此，篩選和鑒定抗棉花黃萎病相關基因是為棉花分子育種提供候選基因的有效途徑。

油菜素甾醇類物質（Brassinosteroids，BR）是植物生長的正調節因子，在植物生長發育及逆境應答中發揮重要作用[5-7]。生理研究表明，BR 能促進細胞伸長，增強植物對環境脅迫的耐受性和對病原體侵染的抵抗力，從而提高作物產量[8]。 BR信號轉導組分主要包括BZR1、BES1（也稱BZR2）、BSK1、BRI1 和BAK1 等[9]。 在植物的免疫機制中，病原體侵入的信號能被BAK1 接收，經過信號傳遞，BR 信號激活磷酸酶PP2A，使BZR1 和BES1去磷酸化，與大量基因的啟動子結合，從而調節這些基因的表達[10-11]。

在病原體侵染植物的過程中，BR 也起重要的作用。 Albrecht 等[12]研究發現，BR 信號可能通過調控富含亮氨酸重復序列（Leucine rich repeat，LRR）的受體激酶BAK1 下游的免疫信號，在植物生長過程中發揮重要的免疫調節作用。 在棉花基因組中鑒定出BAK1同源基因，通過病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技術發現沉默GhBAK1會引發棉花細胞死亡，并伴隨著活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產生， 表明BAK1在棉花抗黃萎病中發揮一定的作用[13-15]。 有研究表明，BES1、BZR1 是BR 信號轉導途徑的關鍵轉錄因子[16]。 對擬南芥的研究發現，WRKY15、WRKY18、WRKY11的基因功能缺失突變能誘發植物體內積累的ROS，使植物產生抗病反應，這些轉錄因子對早期免疫反應具有負調控作用，BZR1 可誘導這些WRKY 轉錄因子的表達。 bHLH 轉錄因子HBI1 是BRZ1 的靶標位點，會抑制病原體相關分子模式（Pathogenassociated molecular pattern，PAMP） 誘導的生長阻滯、 防御基因表達、ROS 爆發以及對病原體的抗性。此外，BZR1 還可以與WRKY40 結合，介導BR 信號與免疫信號之間的拮抗作用，最終BZR1介導的轉錄改變抑制病原體相關分子模式觸發的免疫反應 （PAMP-triggered immunity，PTI）信號[17-18]。 因此，BZR1 是BR 信號的重要調節因子，可誘導PTI 負調控因子的表達，抑制植物的免疫反應，從而利于病原體的入侵。

從育種層面分析，突變或者敲除負調控植物抗性的基因，可能在培育廣譜、持久抗性品系中具有很好的應用前景。 目前，棉花中BZR1基因的研究主要集中在棉纖維發育、抗旱等生理功能方面[19-20]，對棉花黃萎病抗性中的功能研究鮮有報道。 因此，本研究通過對GhBZR1進行全長克隆、生物信息學分析、黃萎病菌和激素脅迫后的表達模式分析及VIGS 等功能驗證， 明確其在陸地棉抗黃萎病中的作用，為利用分子技術培育抗病品種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養

所用材料為陸地棉抗黃萎病品系中植棉KV-3、KV-6 和KV-2；陸地棉感黃萎病品種（系）冀棉11 號、新陸早6 號、新陸早13 號和86-1。將上述種子分別脫絨、消毒處理后，點種于花盆中 （營養土與蛭石體積比為2∶1）， 置于溫度24 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗、相對濕度為70%的溫室生長。

1.2 GhBZR1 基因的克隆

比較接種和未接種黃萎病菌的中植棉KV-3的轉錄組測序結果，篩選得到GhBZR1基因。 采用RNA prepPure 植物多酚多糖總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取棉花品種86-1 真葉的RNA， 并用微量分光光度計進行濃度及質量檢測，－80 ℃保存備用。 利用cDNA末端快速擴增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）技術克隆GhBZR1基因全長。 通過3′-Full RACE Core Set with Prime Script RTase 試劑盒（寶日醫生物技術有限公司，北京）獲得GhBZR1基因3′端非翻譯區（Untranslated region, UTR），使用SMART RACE 5′/3′ Kit User Manual 試劑盒（寶日醫生物技術有限公司， 北京） 獲得Gh-BZR1基因5′端UTR。 RACE 所需的引物（表1）通過引物設計軟件Primer 5 設計完成，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 生物信息學分析

利用Genbank 的Blast 找出同源蛋白序列，通過多序列比對及MEGA 5.2 軟件（Booststrap值設為1 000），構建GhBZR1 及同源蛋白的系統發育樹。利用NCBI 的ORF Finder 程序查找開放閱讀框， 之后通過相關生物信息學方法分析Gh-BZR1 蛋白的生理生化特性， 具體操作參照任玉紅[22]的方法。 為了預測GhBZR1基因可能具有的生物學功能，利用Blast 根據基因ID 從陸地棉基因組序列中調取該基因起始密碼子上游1 000 bp的序列，隨后將調取到的啟動子序列提交到Plant CARE 網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對順式作用元件進行預測分析。

1.4 GhBZR1 瞬時表達載體構建及亞細胞定位

利用引物擴增GhBZR1基因的編碼序列（Coding sequence，CDS）（去除終止密碼子），插入到亞細胞定位表達載體35S∷GFP 的多克隆位點XmaⅠ和XbaⅠ間， 與綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因融合表達，將重組質粒轉化農桿菌菌株EHA105，－80 ℃保存。 亞細胞定位以本氏煙草為材料， 侵染緩沖液的制備、熒光觀察等操作參照敬丹等[23]的方法。

1.5 GhBZR1 基因在不同棉花材料中的表達分析

將抗黃萎病的中植棉KV-3、KV-6 和KV-2，以及感黃萎病的冀棉11 號、新陸早6 號、新陸早13 號，培養至第2 片真葉完全展開時，接種大麗輪枝菌V991。 制備1.0×107mL－1的黃萎病菌V991 孢子懸浮液，采用蘸根法接菌，分別于處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和144 h 取棉株葉片，以未按菌處理為對照（CK），保存于－80 ℃超低溫冰箱[21]。 提取各材料的總RNA并稀釋至1 000 mg·L－1，進行熒光定量檢測。 按照FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒 （天根生化科技有限公司，北京）說明書合成cDNA。 根據Super-Real PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說明書在ABI7500 Real-time PCR system 熒光定量儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應 （Real-time quantitative Polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析。 以陸地棉Ubiquitin基因為內參基因，每個處理設3 次生物學重復，采用2－ΔΔCt 法進行數據分析，檢測黃萎病菌侵染后抗病和感病棉花品種（系）中GhBZR1基因的表達情況。

1.6 激素處理后GhBZR1 基因的表達分析

待棉花86-1 幼苗長至第2 片真葉展開時，分別配制含0.01 mmol·L－1茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和0.1 mmol·L－1水楊酸（Salicylic acid，SA）的植物培養液浸泡棉花幼苗，以正常的植物培養液培養為對照，并在處理后0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 取棉花完整根部材料，－80 ℃保存。 然后提取RNA 進行qRT-PCR 試驗，方法同1.5。

1.7 VIGS 技術研究GhBZR1 基因功能

設計引物（表1）克隆GhBZR1片段，插入到VIGS 載體pCLCrVA 多克隆位點SpeⅠ和PacⅠ間，將構建好的載體通過凍融法轉化農桿菌菌株EHA105。 待感黃萎病棉花品種陸地棉86-1 的子葉完全展開時， 用乙酰丁香酮溶液重懸上述菌體， 將含陽性載體的菌液與含pCLCrVB 的菌液1∶1 等體積混合，室溫靜置3 h 后對棉花子葉進行接種[21]。 以接種pCLCrVA 和pCLCrVB 混合菌液的棉株作為空載體對照，以接種pCLCrVAGhCLAI 和pCLCrVB 混合菌液的棉株作為陽性對照，具體操作參照劉凱等[21]的方法。將沉默后的棉株置于培養箱中， 晝夜溫度分別為25 ℃、20℃，光照16 h/黑暗8 h 條件下培養。 17 d 后采集葉片，提取總RNA 反轉錄后，利用qRT-PCR 檢測基因表達量，每個材料設3 次生物學重復。

在VIGS 處理后18 d， 用注射器吸取大麗輪枝菌V991 孢子懸浮液（1.0×107mL－1）100 μL，從沉默植株子葉下方1 cm 莖部刺入，注射菌液。 接菌后6 d，調查植株真葉的發病情況，并計算病情指數（Disease index，DI），病情指數＝∑（各級病株數×相應病級值）/（調查總株數×最高病級值）×100。 分級標準[24]如下：0 級為植株無癥狀表現；1級為1～2 片真葉發病；2 級為3～4 片真葉發病；3 級為4 片以上真葉發病或脫落；4 級為全株枯死。

1.8 GhBZR1 基因超表達載體構建及抗病性鑒定

1.8.1GhBZR1 基因超表達載體構建及遺傳轉化。 根據表1 中的超表達引物通過PCR 擴增GhBZR1的CDS 并插入pZP111-eGFP 多克隆位點BamHⅠ和XbaⅠ間， 利用凍融法將構建好的載體轉化農桿菌菌株EHA105。然后轉化擬南芥，遺傳轉化及篩選參照任玉紅[22]的方法。

1.8.2轉基因擬南芥的功能研究。 通過qRT-PCR技術檢測T2代陽性轉基因擬南芥中的目的基因表達量。 以Atactin-12為內參基因，每個處理設3 次生物學重復，采用2－ΔΔCt 法進行相對定量分析。

將生長4 周的野生型和轉基因擬南芥從土壤中分離， 洗凈根部后， 將根部在大麗輪枝菌V991 孢子懸浮液（1.0×107mL－1）中浸泡5 min，以在蒸餾水中浸泡的擬南芥作為空白對照，然后種植于花盆中。 接種大麗輪枝菌V991 后10 d，開始調查植株發病情況，病情指數計算參照1.7。

2 結果與分析

2.1 GhBZR1 基因全長的獲得

提取陸地棉86-1 葉片總RNA 經1.2%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳（圖1A）和微量紫外分光光度計檢測純度和濃度均合格。通過RACE 技術獲得350 bp 的3′端UTR 和223 bp 的5′端UTR；根據BZR1基因的同源序列設計中間引物GhBZR1-F、GhBZR1-R， 擴增出942 bp 的大片段；設計引物進行全長擴增得到完整的GhBZR1基因序列1 515 bp（圖1B）。

圖1 總RNA 和GhBZR1 基因電泳結果Fig. 1 Electrophoresis of total RNA and GhBZR1 gene

2.2 GhBZR1 生物信息學分析

GhBZR1基因的開放閱讀框長度為942 bp，編碼313 個氨基酸。蛋白的相對分子質量為34.332×103，等電點為9.00，分子式為C1512H2346N434O465S9，包含30 個帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酸殘基，36 個帶正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基。該蛋白由20 種氨基酸組成，其中絲氨酸和脯氨酸所占比例較大，分別是13.1%和12.8%；該蛋白的不穩定系數為65.96，屬于不穩定蛋白。預測顯示，GhBZR1蛋白是親水性蛋白，無信號肽結構、無跨膜結構，具有BES1_N 超家族結構域。

通過在線軟件Netphos 3.0 Server 分析GhBZR1 蛋白氨基酸序列， 共發現35 個絲氨酸位點、15 個蘇氨酸位點和1 個絡氨酸位點可能被磷酸化，說明該蛋白可能被激酶磷酸化。

系統進化分析表明，GhBZR1 與海島棉（G.barbadense）、雷蒙德氏棉（G. raimondii）中BZR1蛋白相似度最高、親緣關系最近；與可可（Theobroma cacao）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）、木槿（Hibiscus syriacus）中BZR1 蛋白親緣關系較近（圖2）。

圖2 GhBZR1 的系統發育樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of GhBZR1

GhBZR1 基因啟動子區域順式作用元件預測結果篩選，共發現3 類相關作用元件（表2），分別是1 個與防御和應激反應相關的作用元件TC-rich repeats，2 個響應脫落酸的ABRE 順式作用元件，1 個MBSI 作用元件（MYB 結合位點），可能參與調控類黃酮生物合成基因表達。

表2 GhBZR1 啟動子中與抗病性相關的順式作用元件Table 2 Pathogenesis-related cis-acting elements in the promoter of GhBZR1

2.3 GhBZR1 蛋白的亞細胞定位分析

激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片熒光的分布， 空載體GFP 信號分布在細胞核和細胞質；而GhBZR1與GFP 共表達時，熒光僅分布在細胞核（圖3），說明GhBZR1 蛋白定位于細胞核，符合轉錄因子的基本特征。

圖3 GhBZR1 蛋白的亞細胞定位Fig. 3 Subcellular localization of the GhBZR1 protein

2.4 黃萎病病菌脅迫后不同棉花品種（系）中GhBZR1 基因的表達分析

接種大麗輪枝菌后，GhBZR1基因在感病和抗病棉花葉片中的表達情況見圖4。 感病品種冀棉11、新陸早6 號和新陸早13 號的GhBZR1基因均在接種后12 h 左右受到大麗輪枝菌誘導上調表達。 在抗病棉花材料中植棉KV-3、KV-6 和KV-2 中，GhBZR1基因表達變化規律不一致。 與CK 相比，KV-3 接菌后24 hGhBZR1基因顯著下調表達，KV-6 接菌后6 hGhBZR1基因顯著下調表達，KV-2 接菌后48 h、72 hGhBZR1基因顯著下調表達。 這表明，不同抗病棉花材料接種大麗輪枝菌后，GhBZR1基因的響應和表達模式不同，總體呈現下調表達趨勢。

圖4 黃萎病菌脅迫后GhBZR1 基因在不同抗病性品種（系）中的表達分析Fig. 4 Expression analysis of GhBZR1 gene in different cotton varieties (lines) with infection of V. dahliae

2.5 SA 和JA 處理后GhBZR1 基因的表達模式

GhBZR1基因在陸地棉86-1 苗期的根、 莖、葉中均有表達， 在莖中的相對表達量是葉中的1.87 倍，是根中的44.67 倍（圖5A）。 JA 處理后0.5 h，GhBZR1表達量顯著上調，之后緩慢下調，處理后12 h 表達量又上升，隨后又下降，呈現“升-降-升-降”的表達趨勢（圖5B）。SA 處理后3 h，GhBZR1轉錄水平達到峰值，然后下降至原表達水平（圖5C）。 這些結果表明，植物激素JA 和SA都能誘導GhBZR1的表達。

圖5 激素處理下GhBZR1 的表達模式Fig. 5 The expression patterns of GhBZR1 with hormone treatments

2.6 GhBZR1 基因功能分析

在VIGS 處理后18 d，pCLCrVA-GhCLA1-pCLCrVB 陽性對照棉花葉片出現白化癥狀（圖6A），GhBZR1沉默棉株中GhBZR1表達量較空載體對照下降39%（圖6B）。

接種棉花黃萎病菌懸浮液9 d 后， 野生型和轉化空載體的棉株出現葉片邊緣部位變軟、失水等明顯的黃萎病癥狀，而GhBZR1沉默棉株癥狀較輕（圖6C）。 18 d 后，GhBZR1沉默植株的病情指數為64.8±1.3，比轉化空載體pCLCrV（A＋B）的植株（94.1±2.1）和野生型86-1 植株（92.3±3.2）的病情指數低（圖6D）。 綜上，沉默GhBZR1基因可增強感病品種86-1 對黃萎病的抗性。

圖6 GhBZR1 基因的功能分析Fig. 6 Function analysis of the GhBZR1 gene by VIGS

2.7 轉GhBZR1 擬南芥的篩選及抗病性鑒定

利用載體攜帶的卡那霉素抗性基因篩選轉基因擬南芥， 結合GhBZR1表達量的分析結果，獲得14 株T2代轉GhBZR1擬南芥，其中9 號株系GhBZR1基因的表達量最高，選擇9 號進行后續試驗研究（圖7A）。

通過蘸根法對野生型擬南芥、轉GhBZR1基因擬南芥、轉空載體擬南芥接種黃萎病菌V991，20 d 后可觀察到明顯的癥狀，轉基因擬南芥葉片出現萎蔫、黃化及局部壞死；轉空載體擬南芥葉片癥狀較輕，野生型擬南芥僅有部分葉片出現黃化（圖7B）。 接種后35 d 轉基因株系的病情指數為82.8±3.8，比野生型擬南芥（56.1±2.0）和轉化空載株系（53.3±0.1）的病情指數高（圖7C）。 結果表明，超表達GhBZR1基因會使擬南芥對黃萎病的抗性減弱。

圖7 GhBZR1 轉基因擬南芥植物的篩選和黃萎病抗性檢測Fig. 7 Screening and V. dahliae resistance of GhBZR1 transgenic Arabidopsis plants

3 討論

BZR1 是BR 信號通路中的重要轉錄因子之一，是植物防御系統的1 種信號分子，可以誘導防御基因的表達抵御外界脅迫[25]。 啟動子對基因的調控起重要作用，順式元件的數量和種類都能影響基因的表達模式[26]。 生物信息學預測顯示，GhBZR1基因的啟動子有3 種與抗病原菌相關的順式作用元件TC-rich repeats、ABRE 和MBSI，分別參與植物的防御和應激反應、響應脫落酸以及類黃酮生物合成基因的調控。 植物激素對植物自身的生長發育以及對外界壞境脅迫的響應至關重要[27]。 關于植保素的研究主要集中在類黃酮和萜類植保素，一般認為天然類黃酮化合物中的一些酚類物質具有抗細菌、抗真菌、抗病毒活性，用SA 處理接種鏈格孢菌（Alternaria alternate）的杏果， 能促進類黃酮和木質素等抗性物質的積累，從而提高杏果對黑斑病的抗性[28-29]。脫落酸介導的植物抗逆信號轉導與許多基因的誘導表達有關，許多響應脫落酸的基因啟動子區域都有1 個保守的ACGT 核心（G 盒）[30]。GhBZR1基因的啟動子區域存在與抗病相關的順式作用元件，表明該基因可能在激素信號轉導及植物抗性中發揮重要作用。 系統發育樹分析顯示，GhBZR1 蛋白與海島棉、雷蒙德氏棉中的同源蛋白相似度很高，推測該蛋白序列保守且廣泛存在于各棉花品種中。

在抗黃萎病過程中，SA、JA 和乙烯是抗病性信號轉導途徑中的重要調節因子[31]。 SA 是1 種廣泛存在于植物和細菌中的小分子酚類物質，參與植物生長發育的多個過程[32]。 目前的研究主要集中在SA 在植物免疫中的作用，SA 能夠介導PTI 和效應子觸發的免疫（Effector-triggered immunity，ETI）2 種植物免疫反應[33-34]。 JA 是一類脂肪酸的衍生物，在植物抗病中可作為信號分子，激活植物的防御系統，從而提高植物對病原體的抵抗力。JA 還可以通過與乙烯的協同作用增強植物的抗性。 有研究證實，在棉花中JA 信號通路參與對黃萎病菌的早期防御反應[35]。GhBZR1的表達能被外源SA、JA 誘導， 推測GhBZR1可能參與植物激素信號調控通路。 接種黃萎病菌之后，GhBZR1在感病品種中呈現上調表達趨勢， 在抗病品種中則呈現下調表達的趨勢，表明GhBZR1基因在抗病性不同的品種中的表達有差異，推測該基因的表達有利于黃萎病菌的侵入。

沉默感黃萎病陸地棉86-1 的GhBZR1基因，能增強其對黃萎病的抗性；超表達GhBZR1基因導致擬南芥對黃萎病的抗性減弱，加重葉片枯萎和死亡。亞細胞定位分析顯示，GhBZR1 蛋白定位在細胞核，符合轉錄因子的特點[36]。 推測黃萎病菌侵染棉花時，GhBZR1 可能通過調控下游基因轉錄來實現抗病反應。

4 結論

本研究通過RACE 技術克隆得到GhBZR1基因，基因全長1 515 bp，編碼313 個氨基酸。GhBZR1 蛋白由20 種氨基酸組成，無信號肽結構和跨膜結構，屬于親水性蛋白，具有BES1_N 超家族結構域，為轉錄因子，定位于細胞核。GhBZR1能被黃萎病菌、JA 和SA 誘導表達。 通過VIGS技術沉默GhBZR1能增強感病陸地棉86-1 對黃萎病的抗性；超表達GhBZR1基因使擬南芥對黃萎病抗性減弱。 綜上，GhBZR1基因編碼1 個負調控黃萎病抗性的轉錄因子。