甲哌钅翁通過調節棉花葉片水分平衡和光合性能提高苗期耐旱性的生理機制

王玉賢，董瑩瑩，李芳軍，杜明偉，田曉莉，李召虎

（中國農業大學農學院/ 作物化控研究中心/ 植物生長調節劑教育部工程研究中心，北京 100193）

我國是原棉生產大國，棉花種植區域主要分布在干旱和半干旱地區，常受到春旱、伏旱或秋旱的威脅， 其中春旱對出苗和苗期生長影響較大。 干旱脅迫下，植物會在組織和細胞水平發生多種生理生化反應啟動脅迫應答，如積累脯氨酸等低分子量滲透調節物質防止細胞失水[1]；積累超氧化物歧化酶、過氧化物酶和抗壞血酸等抗氧化物質消除過多的活性氧[2]；形成水通道蛋白、晚期胚胎發生豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）等具有保護和調節細胞功能的蛋白[3]；以及加快根系生長增強吸水能力、減少蒸騰增加保水能力[4]。此外，耐旱性強的物種或品種能減輕干旱對葉綠素含量和凈光合速率的負面影響，保護光合系統Ⅱ[5-6]。

植物生長調節劑不僅可以調控植物的生長發育， 也可以提高植物抵抗生物和非生物逆境的能力[7-9]。甲哌钅翁（Mepiquat chloride，DPC）是在棉花生產中廣泛應用的植物生長調節劑[10]，通過抑制赤霉素（Gibberellin，GA）關鍵合成酶柯巴基焦磷酸合酶 （Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）和內根-貝殼杉烯合酶（Ent-kaurene synthase，KS）編碼基因的表達降低內源GA 含量，從而延緩莖枝的伸長生長[11]。 此外，有研究表明DPC 浸種可增強作物抵御苗期干旱脅迫的能力[12-16]，但存在延遲出苗、降低出苗率的風險[17]。為明確棉花苗期葉面噴施DPC 是否也具有提高棉株抗旱能力的作用，本文從形態、光合特性、水分平衡及利用等方面進行了探索。研究結果不僅可挖掘DPC的調控潛力，而且有助于完善其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2018―2019 年在中國農業大學植物培養室進行。 試驗材料為陸地棉（Gossypium hirsutumL.）品種中棉所41，由中國農業科學院棉花研究所和河北省河間市國欣農村技術服務總會提供。DPC 為98%（質量分數，下同）可溶性粉劑，由河北國欣諾農生物技術有限公司提供。

挑選飽滿一致的棉花種子， 在3%過氧化氫溶液中浸泡15 min，之后用清水沖洗3～5 次、用去離子水沖洗2 次，于28 ℃下避光浸種12 h。 挑選露白一致的種子播種于裝有450 g 混土（營養土和蛭石體積比為10∶1）的花盆中（直徑25 cm，高20 cm），每盆播6～8 粒種子，生長至2 葉期后保留3 株長勢一致的幼苗。

培養室光照強度為（400±100）μmol·m－2·s－1，光照/黑暗時間為14h/10h，晝夜溫度為（28±2）℃/（22±2）℃，相對濕度為65%。

試驗設置4 個處理：CK-Ctrl （正常供水＋噴施清水）、CK-DPC（正常供水＋噴施DPC）、DSCtrl（干旱＋噴施清水）、DS-DPC（干旱＋噴施DPC）。于2 葉期，葉面噴施濃度為30 mg·L－1的DPC，以等量清水為對照，噴至葉片完全濕潤。 鑒于噴施DPC 后4 d 可顯著影響棉花的多項生理指標[18]，因此本研究選擇DPC 處理5 d 后進行控水干旱處理，對照組（CK-Ctrl，CK-DPC）正常供水。 正常供水處理為每2～3 d 澆1 次水，將托盤中加水直至花盆中表層土壤濕潤后倒掉多余水分；干旱處理前澆1 次水，之后不再澆水進行干旱處理，直至棉花幼苗出現干旱表型，進行觀察和拍照記錄； 干旱處理7 d 后待棉花幼苗均呈現出明顯的干旱表型，拍照記錄表型，之后進行復水，觀察植株的生長恢復表型，6 h 后拍照記錄表型。各處理重復6 盆，4 個處理的植株置于同一托盤中培養。

1.2 測定指標和方法

1.2.1生物量。干旱處理7 d 后，取完整植株將根部沖洗干凈，用吸水紙將多余水分吸干，分離地上部和地下部， 置于105 ℃烘箱中殺青0.5 h 后將溫度調至85 ℃烘至恒重并稱量干物質質量。各處理重復3 株。

1.2.2葉片相對含水量。 干旱處理5 d 后，取第2片葉稱量鮮物質質量， 用去離子水浸泡至恒重，吸干表面水分后稱量飽和鮮物質質量， 之后置于80 ℃烘箱中烘至恒重并稱量干物質質量。 用以下公式計算葉片相對含水量（Relative water content RWC）：

相對含水量（%）＝（葉鮮物質質量－葉干物質質量）/（葉飽和鮮物質質量－葉干物質質量）×100%.

1.2.3葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量。 分別于干旱處理后0、1、2、4、6 d 取幼苗第2 片真葉， 采用考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白含量[19]。 參照孔祥生等[20]的方法測定游離脯氨酸含量。

1.2.4葉綠素含量。干旱處理5 d 后，使用直徑為0.6 cm 的打孔器從各處理植株的第1、2 和3 片葉取樣， 每株共取60 個葉圓片， 取樣面積為0.28 cm2。將葉圓片置入96%乙醇溶液中，避光浸提24 h 至葉片完全脫色， 使用分光光度計測定665 nm 和649 nm 處的吸光值， 按照下列公式計算葉綠素含量：

葉綠素a 濃度 （mg·L－1）＝13.95×OD665－6.88×OD649；

葉綠素b 濃度 （mg·L－1）＝24.96×OD649－7.32×OD665；

葉綠素含量（mg·cm－2）＝色素濃度×提取液體積×稀釋倍數/樣品面積；

總葉綠素含量（mg·cm－2）＝葉綠素a 含量＋葉綠素b 含量。

1.2.5葉片光合參數。 干旱處理5 d 后，用LI-6400 便攜式光合系統（LI-COR，Lincoln，NE，USA）測定第2 片真葉的凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、 氣孔導度 （Stomatal conductance，Gs）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr）及胞間CO2濃度（Intercellular CO2concentration，Ci）。人工光源的光強為500 μmol·m－2·s－1。

1.2.6水分利用率（Water use efficiency，WUE）。WUE 按以下公式[21-22]計算：

水分利用率＝凈光合速率（Pn）/ 蒸騰速率（Tr）×1000。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2010 對數據進行整理、計算和作圖， 用SPSS Statistics 21 的一般線性模型（General linear model，GLM）進行方差分析，用鄧肯多重范圍檢驗（Duncan’s）法對各處理進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 葉面噴施DPC 對棉花幼苗形態和干物質質量的影響

就各處理棉苗生長表型看（圖1A），正常供水條件下，CK-DPC 處理的棉花植株與CK-Ctrl相比葉片較小， 植株較矮。 干旱脅迫7 d 后，DS-DPC 與DS-Ctrl 處理的幼苗葉片均出現萎蔫，但DS-DPC 處理降低了葉片萎蔫程度。 復水6 h 后，DS-DPC 的幼苗葉片較DS-Ctrl 更快恢復平展。 根據棉苗地上部和地下部干物質質量變化（圖1B 和1C）， 在正常供水條件下，CK-DPC 處理抑制了植株地上部的生長。 干旱脅迫7 d 后，DS-Ctrl 處理地上部干物質質量較CK-Ctrl 顯著下降，降幅為71.0%；而DS-DPC 處理地上部干物質質量與CK-DPC 相比下降62%，DPC 處理與清水對照相比降幅減少了9.0 百分點（圖1B）。

無論供水條件如何，與清水對照相比，噴施DPC 對地下部根系干物質質量無顯著影響。干旱脅迫7 d 后，DS-Ctrl 處理的根系干物質質量較CK-Ctrl 降低14%；與CK-DPC 相比，DS-DPC 處理的根系干物質質量降低11%；DPC 處理與清水對照處理相比， 根系干物質質量降幅減少了3.0 百分點（圖1C）。 說明DPC 處理能夠緩解干旱對棉花幼苗的生長抑制，且對地上部的緩解作用更明顯。

圖1 噴施DPC 對干旱脅迫下棉苗生長的影響Fig. 1 Effects of spraying DPC on the development of cotton seedlings under drought stress

2.2 DPC 對棉苗葉片相對含水量的影響

正常供水條件下，CK-DPC 處理的棉花幼苗葉片相對含水量與CK-Ctrl 處理無顯著差異。 脅迫條件下，DS-DPC 處理的葉片相對含水量較DS-Ctrl 顯著增加12.06%（圖2）， 表現出較強的保水能力。

圖2 噴施DPC 對棉苗葉片相對含水量的影響Fig. 2 Effects of spraying DPC on the relative water content of cotton leaves

2.3 噴施DPC 對干旱脅迫下葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是重要的滲透調節物質[23]，干旱脅迫下，DS-Ctrl 處理的脯氨酸含量較CK-Ctrl 處理有所增加；DS-DPC 處理的脯氨酸含量較CK-DPC有所增加。 除干旱處理6 d 后， 在不同供水條件下，DPC 處理組的脯氨酸含量較清水處理組均有所增加（圖3）。 CK-DPC 處理的脯氨酸含量在第2 天和第4 天分別較CK-Ctrl 顯著增加53.9%和79.0%。 脅迫條件下，DS-DPC 處理的脯氨酸含量在第1 天和第2 天分別較DS-Ctrl 顯著增加84.3%和58.8%。 上述研究結果表明DPC 可以通過促進棉花幼苗中的滲透調節物質的積累來應答干旱脅迫。

圖3 噴施DPC 對干旱脅迫下葉片脯氨酸含量的影響Fig. 3 Effects of spraying DPC on proline content in leaf under drought stress

2.4 各處理下DPC 對棉花幼苗光合特性的影響

正常供水條件下，CK-DPC 處理增加了葉片的葉綠素含量，但與CK-Ctrl 相比差異不顯著。干旱脅迫5 d 后，DS-Ctrl 處理的葉片葉綠素含量與CK-Ctrl 相比顯著下降，降幅為30.7%；而DS-DPC處理緩解了干旱脅迫對葉綠素的破環， 與CK-DPC處理相比降幅為18.9%， 且與CK-Ctrl 相比無顯

著性差異（圖4A）。

正常供水條件下，CK-DPC 處理的幼苗葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）與CK-Ctrl 相比均無顯著差異（圖4B～E）。 干旱脅迫后，相較DS-Ctrl 處理，DS-DPC 處理的Pn和Tr分別顯著增加149.1%和85.9%，Ci顯著降低18.0%，Gs有所增加，但無顯著性差異。

2.5 噴施DPC 提高干旱脅迫下棉花幼苗水分利用率

正常供水條件下，CK-DPC 處理的水分利用率較CK-Ctrl 處理無顯著差異。 干旱脅迫5 d 后，DS-Ctrl 處理的水分利用率較CK-Ctrl 顯著下降，DS-DPC 處理的水分利用率較DS-Ctrl 顯著增加67%， 且與CK-DPC 處理組相比無顯著差異（圖4F）。

圖4 噴施DPC 對棉花幼苗光合參數的影響Fig. 4 Effects of spraying DPC on photosynthetic parameters of cotton seedlings

2.6 各處理下DPC 對棉苗葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可見， 無論供水條件如何，DPC 處理均可增加葉片中可溶性蛋白含量。 實施干旱脅迫的第2 天，CK-DPC 處理的可溶性蛋白含量較CK-Ctrl 顯著增加62.6%。DS-DPC 處理的可溶性蛋白含量在第1 天和第2 天分別較DS-Ctrl 顯著增加192.7%和28.2%。

圖5 噴施DPC 對干旱脅迫下棉花葉片可溶性蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of spraying DPC on soluble protein content of cotton seedlings under drought stress

3 討論

研究發現干旱脅迫條件下， 葉面噴施DPC可顯著提高棉花幼苗的相對含水量、凈光合速率和水分利用率，可通過調節水分平衡和光合性能增強棉花抵御干旱脅迫的能力。

3.1 DPC 處理降低干旱脅迫造成的地上部干物質損失

干旱脅迫可嚴重影響棉花的干物質積累[24]。本研究中DS-Ctrl 和DS-DPC 處理的地上部干物質質量較正常供水處理均顯著減少， 但DS-DPC處理的地上部干物質質量下降程度小于DS-Ctrl（圖1B）。 Niakan 等[25]的研究結果表明，不同濃度的DPC 對棉花各部位干物質質量影響不同；噴施DPC 0.5～2.0 L·hm－2可顯著縮短植株的莖長，但對地上部的生物量沒有顯著影響。 本研究中， 正常供水條件下噴施DPC 會降低棉花的株高（圖1A），這與DPC 處理植株中調節莖伸長的GA 合成基因CPS和KS的表達水平及蛋白活性的結果一致[26-27]。 而在干旱脅迫條件下，由于植株啟動抗逆應答機制，生長發育受到抑制，如干旱脅迫下轉錄因子TINY 可平衡油菜素內酯信號介導的生長發育和逆境應答[28]。 本研究中干旱處理抑制棉花幼苗地上部的生長與前人研究結果一致， 而DPC 處理通過誘導滲透調節物質的積累、 增強植株葉片光合性能等緩解逆境脅迫，減輕脅迫對棉花地上部生長的抑制效應， 表現為DPC 處理后地上部的干物質損失較清水對照有所降低。

3.2 DPC 可緩解干旱對根系生物量的抑制作用

地下部根系是吸收水分和營養物質的主要場所，根系形態不同的棉花品種對干旱脅迫的反應不同[29]。Wu 等[30]研究發現，200 mg·L－1DPC 浸種能顯著增加棉花萌發階段的側根數。 本研究發現葉面噴施30 mg·L－1DPC 后第12 天對棉花幼苗根系沒有明顯影響，但緩解了干旱對根系生物量的抑制作用（圖1C）。 已有研究表明DPC 處理后10～15 d 為藥效高峰期， 且不同濃度DPC 對棉花根部發育的影響不一[31]。Niakan 等[25]用DPC 0.5～2.0 L·hm－2劑量處理棉花3 周后，發現其地上部株高受到顯著抑制，而根部的長度與對照相比無顯著變化，這與本研究的結果相似。 推測本研究中DPC 對棉花根系形態無明顯調控作用的原因可能是藥劑處理后的時間較短且濃度較低。

3.3 干旱脅迫下DPC 處理調控棉花幼苗的水分保持與利用

水分脅迫條件下，植物地上部的高保水能力對維持胞內水勢，保證各項生理機制的正常運行具有重要意義[32]。 失水率能直接反映植物地上部的持水能力，可作為衡量作物抗旱性的重要指標之一[33]。 滲透調節物質如脯氨酸等小分子化合物能夠提高作物的滲透調節能力，維持胞內水勢穩定以防止細胞過度失水[34]。干旱條件下，植物葉片中的脯氨酸含量可短時間增加200 倍[35]，一方面增強了細胞的滲透調節作用，另一方面其偶極性對膜蛋白起到了一定的保護作用[36]。 田又升等[37]研究發現耐旱型棉苗的脯氨酸合成途徑中的關鍵基因GhP5CS表達水平顯著增加，促進脯氨酸的合成以應對干旱。 本研究發現，干旱脅迫條件下葉面噴施DPC 能有效降低植株地上部的失水速率，減少水分散失；促進植株體內脯氨酸的積累，維持滲透平衡；提高葉片的相對含水量，增強棉花的耐旱性，減輕水分虧缺帶來的生理損傷。

水分利用率是評價作物耐旱性的一個重要指標，受滲透調節、氣孔導度和光合作用等多種因素調控，可用來反映植物水分蒸散和光合作用之間的協調程度。 在玉米和小麥中的研究表明，耐旱性強的品種在干旱脅迫下具有較高的水分利用率[38-39]。本研究中，干旱脅迫7 d 后，棉花幼苗的Tr和Pn降低，但水分利用率較高。表明DPC 可優化干旱脅迫下棉花幼苗的水分利用，從而提高棉花的耐旱性。

3.4 干旱脅迫下DPC 處理提高棉花幼苗的光合效率

光合作用對干旱脅迫非常敏感，當葉片相對含水量低于80%時，凈光合作用將降低50%[40-41]。原因是一方面，干旱使葉綠素減少，葉綠體結構功能退化，RUBP 羧化酶等光合作用酶的活性下降，抑制干物質的生產與積累[40]；另一方面，干旱使氣孔關閉，阻礙CO2的同化進程[41]。 干旱處理5 d 后棉花幼苗的葉綠素含量和凈光合速率顯著降低，葉片的光捕獲能力和碳同化能力下降。 噴施DPC 可使棉花葉片的葉綠素含量和光合速率增加， 但DPC 不同用量對不同品種的影響程度不一[42-43]。本研究中，在正常供水條件下噴施DPC后，葉綠素含量、凈光合速率均呈升高趨勢，但與對照相比無顯著性差異，分析原因可能與棉花品種、DPC 用量以及處理后的取樣時間有關。 干旱脅迫下DS-Ctrl 處理的胞間CO2濃度較CK-Ctrl處理升高、氣孔導度下降，推測凈光合速率的下降是內部光合作用生理機能遭到破壞所致[43]。 與DS-Ctrl 處理相比，DS-DPC 處理葉片的總葉綠素含量提高，胞間CO2濃度降低、氣孔導度升高，說明DPC 減輕了干旱脅迫下非氣孔因素對光合速率的抑制效應， 從而提高了葉片的光合速率，這與DPC 可以緩解干旱對地上部干物質積累的影響一致。

3.5 干旱脅迫下DPC 處理提高棉花幼苗的可溶性蛋白含量

葉片中大部分可溶性蛋白是與光合作用相關的CO2固定酶[45]和逆境蛋白[46-47]。 因干旱脅迫下光合速率顯著下降，推測本研究中可溶性蛋白含量隨脅迫時間延長（脅迫后1～4 d）而增加的現象與逆境蛋白的積累有關。 逆境蛋白可調控細胞內的信號轉導及基因表達，幫助植物適應不利的生長環境[48]。 本研究中，DPC 處理增加了葉片可溶性蛋白的積累， 說明DPC 可能通過促進逆境蛋白合成增強細胞在干旱脅迫下的保護能力。

4 結論

正常供水條件下， 葉面噴施DPC 對棉花幼苗的相對含水量、總葉綠素含量、凈光合速率及水分利用率無顯著影響。 干旱脅迫下，DPC 處理能緩解地上部的水分散失、 增加葉片脯氨酸積累、顯著提高葉片相對含水量，增強葉片的保水能力；還可以提高葉片總葉綠素含量、蒸騰速率、氣孔導度和凈光合速率，增加葉片可溶性蛋白含量，提高水分利用率；綜上，DPC 可通過調節水分平衡和光合性能增強棉花的抗旱性。