星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)選牛樟葉水提物提取工藝*

張 蓓，余瀟苓，萬(wàn)永艷，覃開(kāi)羽，張洪平，梁學(xué)政△

（1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州545026；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州310000）

牛樟樹(shù)為樟科植物，原產(chǎn)地為臺(tái)灣，生長(zhǎng)在海拔450～2 000 m的山林間，因生長(zhǎng)在百年以上的樹(shù)干腐朽之心材內(nèi)壁的真菌——牛樟芝而得名，被譽(yù)為森林中的紅寶石［1］。牛樟芝可抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力等，但生長(zhǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，品種珍稀，不利于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展［2-6］。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，牛樟葉水提物含有大量多糖類成分，開(kāi)展水提物最優(yōu)提取條件研究有一定的研究?jī)r(jià)值［7-10］。本研究中以多糖為指標(biāo)性成分，采用星點(diǎn)響應(yīng)面法優(yōu)選提取方法，以最大程度提取出多糖類成分，為后期進(jìn)一步優(yōu)化提取方法及多糖的純化試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為0.1 mg）；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；UV1780-5型紫外分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理＜中國(guó)＞有限公司）；L600型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為240 W，頻率為40 kHz）

1.2 試藥

牛樟葉由廣西柳州市天姿園藝有限公司提供，經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院吳冰副主任藥師鑒定為樟科植物牛樟的葉子；苯酚（批號(hào)為10015318），硫酸（批號(hào)為10008316），乙醇（批號(hào)為10009164），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833-201707，規(guī)格為100 mg，純度為≥99%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定（硫酸-苯酚法）

溶液制備：取牛樟葉5 g，打粉，過(guò)60目篩，加250 mL蒸餾水，80℃水浴提取60 min，即得供試品溶液。取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.024 8 g，精密稱定，加水定容至250 mL容量瓶中，即得對(duì)照品溶液。

顯色：精密量取多糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，精密加入濃硫酸3.0 mL，充分混勻，90℃水浴30 min。另以蒸餾水為空白對(duì)照同上操作，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL具塞比色管中，加水至1.0 mL，得系列質(zhì)量濃度為0.01984，0.03968，0.05952，0.07936，0.099 2 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸3 mL，搖勻，90℃水浴保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，同法制備空白溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401），在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為Y=5.962 7X+0.033 7，R=0.999 6(n=5）。結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.019 84～0.099 2 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.255 mg/mL）1.0 mL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果平均吸光度值為0.313 4，RSD為1.17%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液1.0 mL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)測(cè)定吸光度，并計(jì)算RSD值。結(jié)果平均吸光度值為0.321 4，RSD為1.67%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備同一批（批號(hào)為20190322）牛樟葉多糖提取液6份，依法顯色后測(cè)定吸光度，并計(jì)算RSD值。結(jié)果樣品中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的RSD為0.59%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品0.5 g，精密稱定，共6份，加入20 mg葡萄糖對(duì)照品，按最優(yōu)提取工藝提取樣品，并將上述多糖置25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配置多糖溶液，顯色后測(cè)定吸光度，并計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 多糖加樣回收試驗(yàn)（n=6）Tab.1 Recovery test of polysaccharide（n=6）

2.2 單因素試驗(yàn)

打粉粒徑：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，分別過(guò)20，24，40，60目篩，浸漬1 h，水浴溫度為80℃，料液比為1∶50（m/V），考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為9.51，10.29，11.67，15.40 mg/g。可見(jiàn)，打粉粒徑越小，多糖含量越高。

浸漬時(shí)間［11］：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，過(guò)60目篩，水浴溫度為80℃，料液比為1∶50（m/V），分別浸漬30，60，90 min，考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為7.63，10.29，11.15 mg/g。可見(jiàn)，浸漬時(shí)間越長(zhǎng)，多糖含量越高。

水浴溫度：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，過(guò)60目篩，浸漬1 h，料液比為1∶50（m/V），分別置70，80，90℃恒溫水浴鍋中，考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為9.27，10.29，13.10 mg/g?？梢?jiàn)，隨著水浴溫度的升高，多糖含量升高。

料液比：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，打粉，過(guò)60目篩，浸漬90 min，水浴溫度為90℃，分別加40倍、50倍、60倍水，即料液比為1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為13.62，10.29，8.94 mg/g。可見(jiàn)，隨著料液比比例的增大，多糖含量降低。

2.3 提取工藝優(yōu)化

提取工藝條件：根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸漬時(shí)間(因素A)、料液比(因素B)、水浴溫度(因素C)為響應(yīng)面模型的 自 變 量，采 用Design-Expert.v8.0.6軟 件，設(shè) 置響應(yīng)值目標(biāo)［浸漬時(shí)間為30～90 min，料液比為1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），水浴溫度最大為100℃］，確定最佳提取工藝。變量因素和水平見(jiàn)表2。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)組合與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，通過(guò)Design-Expert v8.0.6軟件擬合得到的模型，其水平小于0.05，表明該模型有高度顯著性；失擬項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果表明，失擬誤差不顯著（P=0.584 3），表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很小，預(yù)測(cè)回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合很好；預(yù)測(cè)模型的R2=0.996 1，表明多糖含量的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間的一致性較好；該模型的變異系數(shù)(CV)=4.13%＜5%，校正系數(shù)(R2Adj)=0.991 1，表明預(yù)測(cè)模型能反映99.11%響應(yīng)值的變化，故通過(guò)回歸方程能預(yù)測(cè)并分析試驗(yàn)的真實(shí)數(shù)據(jù)。由表4可見(jiàn)，各單因素對(duì)牛樟葉多糖含量(Y)影響從大到小依次為B＞C＞A，料液比與提取溫度間的交互影響最顯著。根據(jù)Design-Expert v8.0.6軟件擬合得回歸方程Y=10.33+1.98A-4.39B+4.28C+0.29AB+0.47AC-2.08BC-2.07A2+2.86B2+2.43C2。

表2 變量因素和水平Tab.2 Variable factors and their levels

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of Box-Behnken experiment

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

響應(yīng)面圖分析：通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元回歸模型所作的響應(yīng)面圖及等高線見(jiàn)圖1。響應(yīng)面的曲面越陡峭，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著；等高線越密集則影響越顯著，越稀疏則影響越小?？梢?jiàn)，液料比所對(duì)應(yīng)的曲面最陡峭，提取時(shí)間所對(duì)應(yīng)的曲面最平滑，表明液料比對(duì)牛樟葉提取多糖含量的影響最顯著，浸漬時(shí)間的影響最小。結(jié)果料液比為1∶40（即40倍蒸餾水）、溫度為90℃、浸漬時(shí)間為75.61 min時(shí)，牛樟葉水提物中多糖提取率最高（26.924 7 mg/g）。

圖1 各影響因素間的交互作用對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖及等高線圖A.The interaction between soaking time and liquid-material ratio B.The interaction between soaking time and extraction temperature C.The interaction between liquid-material ratio and extraction temperatureFig.1 The response surface diagram and contour diagram of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharide

驗(yàn)證試驗(yàn)：取牛樟葉5 g，精密稱定，共3份，按最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，操作方法同前。結(jié)果牛樟葉水提物中多糖含量為26.88 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值26.92 mg/g基本吻合。

3 討論

植物多糖生物活性廣泛，獨(dú)特活性和來(lái)源的天然性在保障人體健康應(yīng)用中具有很大潛力［12-16］。但多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，其結(jié)構(gòu)測(cè)定和分離純化有一定難度；且在天然植物中含量低，不易分離，這給多糖的研究和應(yīng)用帶來(lái)了許多挑戰(zhàn)。Box-Behnken星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法相較于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法，具有預(yù)測(cè)性好、精確度高的特點(diǎn)，故本研究中采用單因素試驗(yàn)與Box-Behnken星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)牛樟葉水提物進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小，表明采用響應(yīng)面法所得優(yōu)化條件穩(wěn)定、可靠。當(dāng)提取工藝參數(shù)為藥材過(guò)60目篩、料液比為1∶40（m/V）、水浴溫度為90℃、浸漬時(shí)間為75.61 min時(shí)，牛樟葉水提物中可提取的多糖含量最高。