兒童傳染性單核細胞增多癥患者外周血T細胞、血漿PD-1和Tim-3水平表達檢測的臨床意義

王衛(wèi)國，王偉偉，馬黎麗（阜陽市人民醫(yī)院檢驗科，安徽阜陽 236001）

傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）是兒童較為常見的急性傳染病，由EB病毒感染導(dǎo)致，發(fā)病后淋巴細胞快速增生，外周血反應(yīng)性淋巴細胞即異型淋巴細胞迅速增高，導(dǎo)致發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、咽峽炎等臨床癥狀出現(xiàn)[1]。IM患兒機體免疫系統(tǒng)應(yīng)答迅速，致使病毒靜息下來，絕大多數(shù)形成潛伏感染，若免疫應(yīng)答低下或過度可形成慢性活動性EB病毒感染或嗜血細胞綜合癥，造成不同的疾病和臨床結(jié)局[2]。程序性死亡分子1（programmed death 1，PD-1）和T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，Tim-3）是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的負性免疫調(diào)節(jié)分子，在抗病毒和維持免疫自穩(wěn)中起著重要作用，乙肝、丙肝和艾滋病等患者中均發(fā)現(xiàn)PD-1和Tim3表達異常[3-4]。PD-1和Tim-3 在兒童IM患者T細胞及血漿中如何表達，目前報道較少，本研究旨在探討上述指標的表達變化及其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2018年3月～2020年2月于阜陽市人民醫(yī)院確診的IM患兒67例，診斷標準參照《諸福棠實用兒科學(xué)》（第8版），男性47例，女性20例，年齡1～8歲，平均年齡3.56±1.91歲。對照組為健康體檢者20例，男性13例，女性7例，年齡1～9歲，平均年齡3.60±2.23歲。兩組間在性別和年齡上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此次研究通過了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。

1.2 試劑和儀器 CD3，CD4，CD8，PD-1，Tim-3，CD45 及相關(guān)同型對照熒光標記抗體購自BD 公司；人血漿PD-1和Tim-3檢測ELISA試劑購自江萊生物公司；芬蘭雷勃mk3 酶標儀和美國BD Calibur 流式細胞儀。

1.3 方法

1.3.1 T細胞PD-1和Tim-3表達檢測:取四支流式管，每種抗體用量為10 μl。第1 和第2 支加入CD3，CD4 和CD45 后，再分別加入PD-1和Tim-3，第3 和第4 支加入CD3，CD8 和CD45 后，再分別加入PD-1和Tim-3，各管加入50 μl EDTA 抗凝全血，避光染色30 min，溶血后離心棄上清，加入磷酸鹽緩沖液上機檢測。cell quest 軟件分析，以百分比（%）表示PD-1和Tim-3 在CD4+和CD8+T細胞上的表達。

1.3.2 血漿PD-1和Tim-3的水平檢測:按試劑盒操作說明書進行：樣本孔和標準品孔各加50 μl 樣品和辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，封板后37℃孵育30 min，洗滌5次后加入酶作用底物，15 min 后加入終止液，于酶標儀450 nm 波長讀取吸光度值，采用曲線回歸方程計算血漿PD-1和Tim-3濃度（ng/ml）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗、t’檢驗和相關(guān)性分析，繪制ROC曲線，評估其診斷的價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IM組和對照組T細胞上PD-1，Tim-3表達百分比比較 見表1，圖1。與對照組比較，IM患兒CD4+T 和CD8+T細胞上PD-1和Tim-3表達百分比均明顯升高（均P＜0.01）。

表1 IM組和對照組CD4+和CD8+ T細胞上PD-1和Tim3表達百分比（%）比較

圖1 PD-1和Tim-3表達流式圖

2.2 IM組和對照組血漿PD-1及Tim-3水平比較 見表2。與對照組比較，IM患兒血漿PD-1和Tim-3濃度明顯升高（均P＜0.01）。ROC曲線分析，血漿PD-1和Tim-3濃度診斷IM的曲線下面積分別為0.794（95%可信區(qū)間為0.694～0.894，P=0.000）和0.722（95%可信區(qū)間為0.611～0.833，P=0.003），Youden指數(shù)最大點對應(yīng)的診斷界值分別為1.24 ng/ml 和0.44 ng/ml，血漿PD-1的敏感度和特異度分別為62.7%和85.0%，血漿Tim-3的敏感度和特異度分別為65.7%和75.0%，兩者聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為52.2%和95.0%，ROC曲線見圖2。相關(guān)性分析，血漿PD-1和Tim-3水平呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.01）。

表2 IM組和對照組血漿PD-1 及Tim-3水平（ng/ml）比較

3 討論

細胞免疫異常是EB病毒感染后發(fā)病和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]：急性期IM患者CD8+T細胞迅速增加；CD4+T細胞分化漂移，效應(yīng)性Th1細胞增加；具有免疫抑制作用的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和CD4-CD8-雙陰性T細胞增加等，表明IM患者抗病毒和抑制性免疫反應(yīng)可同時存在。

圖2 PD-1，Tim-3的ROC曲線

本次實驗發(fā)現(xiàn)：較對照組，IM患兒CD4+和CD8+T細胞表面PD-1 及Tim-3表達明顯升高，血漿中PD-1和Tim-3水平明顯升高。PD-1 在活化的淋巴細胞中誘導(dǎo)性的表達上調(diào)，能抑制T細胞增殖和IL-2 產(chǎn)生，許多病毒和腫瘤均是通過PD-1 途徑逃避機體的免疫防御和監(jiān)視。CD4+T細胞主要包括輔助性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞，IM患者不論哪種類型CD4+T細胞PD-1表達增加，都導(dǎo)致機體快速清除病毒的能力減弱，而且會導(dǎo)致CD8+T細胞向效應(yīng)性的細胞毒性細胞分化減少。CD8+T細胞主要包括抑制性和細胞毒性細胞，IM患兒CD8+T細胞PD-1表達升高，從理論上講是促進抑制性功能和減弱細胞毒作用，但CHATTERJEE 等[7]發(fā)現(xiàn)PD-1 陽性CD8+T細胞保留了增殖、細胞因子產(chǎn)生和細胞毒性的能力，而且在EB病毒特異性細胞毒性CD8+T 上也發(fā)現(xiàn)升高的PD-1表達[6]，提示IM患兒PD-1表達升高可能在抗病毒和維持過度的免疫應(yīng)答方面都起著一定的作用。Tim-3 負性調(diào)節(jié)T細胞的應(yīng)答反應(yīng)，過表達能引起病毒感染過程中T細胞的衰竭，引起免疫功能無能。研究發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤細胞對抗PD-1 發(fā)生耐藥，而抗Tim-3和抗PD-1 聯(lián)合用藥可以解決該問題[8]，也證明了Tim-3 在免疫抑制中的關(guān)鍵作用。與其他免疫檢查點分子不同，Tim-3 不是在所有的T細胞活化后表達增加，只在Th1 和具有細胞毒作用的CD8+T 中表達上調(diào)。IM患兒CD4+和CD8+T細胞Tim-3表達增高，提示兩種主要的抗病毒效應(yīng)細胞存在免疫功能被抑制。血漿PD-1和Tim-3 主要來自于膜型分子的裂解或細胞基因編碼產(chǎn)生，不論是膜型還是可溶性分子，均與受體結(jié)合的信號途徑發(fā)揮作用。PD-1和Tim-3 與其受體的信號途徑可致使病毒特異性T細胞的失能及耗竭，IFN-γ，IL-2 和TNF等抗病毒的細胞因子水平降低，導(dǎo)致病毒感染的持續(xù)或潛伏[8-9]，但新的研究似乎并不支持PD-1 抗體應(yīng)用于EBV感染。ROC曲線顯示：血漿PD-1和Tim3濃度對診斷IM的靈敏度不佳，而特異度較好，兩者聯(lián)合診斷IM的特異度可達95%，顯示其血漿水平在排除性診斷中具有一定的價值。IM患兒血漿PD-1和Tim3水平呈正相關(guān)，提示兩者在抑制性功能上具有協(xié)同作用。

綜上所述，IM患兒PD-1和Tim表達水平升高，一方面降低了免疫應(yīng)答，另一方面可能預(yù)防了過激的免疫反應(yīng)，維持機體相對的免疫自穩(wěn)，致使病毒靜息和潛伏起來。