金黃色葡萄球菌致新西蘭兔膿胸模型的建立以及尿激酶和脫氧核糖核酸酶Ⅰ的作用研究*

李金壟，梁晉華，張真強(qiáng)，王 可

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021）

膿胸是胸膜間隙內(nèi)膿液的積聚，通常為肺部感染繼發(fā)肺旁積液的并發(fā)癥。盡管醫(yī)療進(jìn)步，膿胸依然與高發(fā)病率和死亡率有關(guān)，大約有10%～20%的膿胸患者接受了適當(dāng)?shù)尼t(yī)療治療，最后仍然死亡[1-3]。膿胸的主要細(xì)菌包括有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌等[4]，其中金黃色葡萄球菌是全世界報(bào)告的最常見(jiàn)的膿胸感染微生物[1,5]。膿胸的治療是多樣化的，胸腔引流和纖融治療是膿胸常見(jiàn)的治療方法[1,6-8]。然而，有研究表明，即使胸腔引流聯(lián)合抗生素治療膿胸，胸腔引流依然有一定的治療失敗率[9-10]。一方面，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，致病菌耐藥性在不斷增加；另一方面，膿胸患者住院時(shí)間長(zhǎng)，胸腔引流管放置時(shí)間較長(zhǎng)，可能引起引流管類(lèi)似于血管移植物上的細(xì)菌生長(zhǎng)[11-12]。

膿胸的標(biāo)準(zhǔn)治療由抗生素和胸腔積液的引流組成；當(dāng)膿毒癥和感染性胸腔積液得不到有效控制時(shí)，需要進(jìn)行手術(shù)。數(shù)據(jù)表明，胸膜內(nèi)給藥纖溶藥物通過(guò)切割胸膜內(nèi)纖維蛋白間隔和改善胸管引流可以減少失敗的引流和隨后的手術(shù)頻率[13-14]。此外，胸膜間隙中細(xì)胞外DNA和其他細(xì)菌成分的存在可能增加胸腔積液黏度，應(yīng)用脫氧核糖核酸酶I（DNase I）可能會(huì)改善這種情況[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)建立金黃色葡萄球菌新西蘭兔膿胸模型，進(jìn)一步探究尿激酶和DNase I對(duì)胸腔內(nèi)粘連和纖維蛋白形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)雄性新西蘭兔16 只，體重2.2～2.8 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 桂2014-0003，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0002。飼養(yǎng)條件：室溫25 ℃，適宜濕度，空氣流通，動(dòng)物自由攝食、飲水。本研究符合廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要儀器和試劑 LB 肉湯（北京陸橋公司）；LB 瓊脂粉（北京陸橋公司）；蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶）；戊巴比妥鈉（SIGMA）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 3020）；一次性輸液用頭皮針管（湖南康利萊醫(yī)療器械有限公司）；冷凍離心機(jī)（HERMLE Z326K）；超低溫冰箱（Thermo 995），漩渦振蕩器；分光光度計(jì)（普析通用T6）；超凈臺(tái)（蘇州凈化）；生物安全柜（蘇凈安泰BHC-1300IIA2）；生化培養(yǎng)箱（恒宇SPX-300-II）。

1.3 菌液的制備 本實(shí)驗(yàn)所用菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，儲(chǔ)存于含25%甘油的LB 肉湯培養(yǎng)基中，置于-80 ℃冰箱保存。挑取部分-80 ℃菌液接種至LB瓊脂培養(yǎng)皿中，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。然后挑取單個(gè)菌落接種于LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃，210 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)14～16 h。低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，棄上清液，使用PBS緩沖溶液洗滌，重復(fù)3 次。調(diào)OD450=0.550（菌量為109CFU/mL），用LB 肉湯稀釋成108CFU/mL，使用菌落計(jì)數(shù)法驗(yàn)證菌液濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及新西蘭兔膿胸模型的建立 將16只新西蘭兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=6）、用藥組（n=6）和對(duì)照組（n=4）。實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔在耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉新西蘭兔，左側(cè)臥位固定，剃毛備皮，定位于右側(cè)胸壁第6肋間脊柱前2～3 cm，碘伏消毒鋪巾，皮膚切口約1 cm，通過(guò)鑷子進(jìn)行穿刺，置入剪除針頭的6號(hào)滅菌一次性輸液針管，觀(guān)察導(dǎo)管是否隨呼吸運(yùn)動(dòng)以證實(shí)導(dǎo)管是否進(jìn)入胸腔。用無(wú)菌注射器抽氣，排出穿刺時(shí)可能進(jìn)入胸腔的氣體，然后胸腔按2 mL/kg 體重注入108CFU/mL上述菌液，并再注入1 mL 無(wú)菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管。將輸液針管去除蓋帽端后置入胸腔內(nèi)，縫合穿刺部位皮膚。待兔子蘇醒后送回普通級(jí)飼養(yǎng)區(qū)兔籠，給予水和食物。用藥組注入菌液后，再向胸腔注入1 mg DNase I（上海，索萊寶生物科技有限公司，D8071-25，25 mg）和4 mg 尿激酶（上海，昀冠生物科技有限公司，U108373-10，10 mg）；對(duì)照組新西蘭兔右側(cè)胸腔注入2 mL/kg的LB肉湯，其它操作與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.5 動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)第4 天，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均經(jīng)耳緣靜脈滴注戊巴比妥致死。觀(guān)察兔子胸腔大體觀(guān)，無(wú)菌操作下取樣，收集胸腔積液、胸膜組織及胸腔引流管。

1.6 膿胸模型的驗(yàn)證 取胸腔積液，分析胸腔積液中的白細(xì)胞數(shù)、乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖和pH值（深圳邁瑞生化分析儀BS-2000）。金黃色葡萄球菌膿胸模型建立標(biāo)準(zhǔn)：胸腔積液標(biāo)本明顯化膿，革蘭染色陽(yáng)性，或葡萄糖＜2.3 mmol/L（正常范圍：4.1～5.9 mmol/L）、pH＜7.10、LDH＞1 000 U/L。

1.7 胸膜粘連評(píng)分 由兩位不知實(shí)驗(yàn)分組的人員進(jìn)行胸膜評(píng)分：0分：正常肺和胸膜腔；1分：臟、壁層胸膜間1～3條粘連條帶；2分：胸膜腔內(nèi)3條以上粘連條帶，或少量纖維蛋白沉積；3 分：胸膜腔內(nèi)多處區(qū)域散在粘連條帶，或存在較多纖維蛋白沉積；4分：胸膜腔因粘連而閉合（分離出血），或存在大量纖維蛋白沉積。

1.8 胸膜病理檢查 取各組右側(cè)胸腔膈肌層胸膜組織，10%甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE 染色，光鏡下觀(guān)察胸膜病理變化，并測(cè)定胸膜厚度。

1.9 胸腔留置導(dǎo)管的處理 開(kāi)胸后，使用滅菌器械剪開(kāi)取出胸腔內(nèi)留置導(dǎo)管，無(wú)菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管內(nèi)外表面，并去除導(dǎo)管表面黏附物。每個(gè)樣本取3 cm長(zhǎng)的導(dǎo)管，剪成小段，放入裝有2 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中，使用漩渦震蕩儀震蕩10 min，取導(dǎo)管震蕩液稀釋100倍或1 000倍后稀釋涂盤(pán)，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果記作lg（CFU/mL）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿胸模型評(píng)估 3組均無(wú)動(dòng)物死亡。實(shí)驗(yàn)期間，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組飲食和飲水稍減少，排便正常，精神萎靡，活動(dòng)減少；用藥組無(wú)明顯變化。本研究建立膿胸模型12只，術(shù)后4 d抽取胸腔積液，實(shí)驗(yàn)組胸腔積液混濁，革蘭染色發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌，胸膜腔內(nèi)較多纖維蛋白沉積，胸膜腔內(nèi)大量粘連條帶；用藥組胸腔積液稍混濁、量少，革蘭染色發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌，胸膜腔內(nèi)纖維蛋白沉積和粘連條帶明顯減少。實(shí)驗(yàn)組和用藥組胸腔積液pH＜7.1，LDH＞1 000 U/L，符合膿胸標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組胸腔內(nèi)無(wú)明顯胸腔積液、膿絮狀物及粘連，胸膜表面光滑，見(jiàn)圖1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組和用藥組胸腔積液各指標(biāo)比較 用藥組白細(xì)胞數(shù)顯著少于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），兩組LDH、葡萄糖和pH 值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和用藥組胸腔積液各指標(biāo)比較

表1 實(shí)驗(yàn)組和用藥組胸腔積液各指標(biāo)比較

與實(shí)驗(yàn)組比較，*P＜0.05。

2.3 3組胸膜粘連評(píng)分和胸膜厚度比較 實(shí)驗(yàn)組和用藥組胸膜粘連評(píng)分和胸膜厚度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），用藥組胸膜粘連評(píng)分和胸膜厚度均明顯低于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3組胸膜粘連評(píng)分和胸膜厚度比較

表2 3組胸膜粘連評(píng)分和胸膜厚度比較

與實(shí)驗(yàn)組比較，aP＜0.05；與用藥組比較，bP＜0.05。

2.4 胸膜組織病理檢查 與對(duì)照組相比，用藥組和實(shí)驗(yàn)組胸膜均不同程度增厚，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與用藥組比較，實(shí)驗(yàn)組胸膜明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，可見(jiàn)較多膠原組織沉積，見(jiàn)圖2。

2.5 胸膜腔留置導(dǎo)管的菌落計(jì)數(shù) 用藥組胸膜腔內(nèi)導(dǎo)管菌落數(shù)量（4.7±0.48）與實(shí)驗(yàn)組（5.12±1.01）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組胸膜腔內(nèi)導(dǎo)管未培養(yǎng)出細(xì)菌。

圖2 新西蘭兔膿胸膈肌面胸膜HE染色圖（×100）

3 討論

國(guó)外關(guān)于膿胸動(dòng)物模型研究已有大量報(bào)道，多數(shù)應(yīng)用新西蘭兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槟壳罢T導(dǎo)膿胸形成多數(shù)必須先人為造成無(wú)菌性炎癥，小型動(dòng)物(如小鼠和大鼠)往往無(wú)法耐受，在膿胸形成之前即死亡。兔體形稍大，對(duì)炎癥有較好的耐受性[16]。因此，本研究選用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道用兔致病菌巴斯德桿菌直接誘導(dǎo)膿胸，然而該模型多用于膿胸診斷和治療的研究，難以用于其他細(xì)菌與膿胸的相關(guān)研究[17]。本研究建立了一種引流管相關(guān)的金黃色葡萄球菌膿胸模型，為進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌與膿胸及引流管之間的發(fā)生和發(fā)展提供可能。

在之前的研究中，筆者用銅綠假單胞菌成功建立了引流管相關(guān)膿胸模型[18]，本實(shí)驗(yàn)采用了類(lèi)似的方法。該模型的主要優(yōu)勢(shì)：（1）膿胸的形成是一致性的，無(wú)需先誘導(dǎo)無(wú)菌性胸膜炎；（2）金黃色葡萄球菌是引起人膿胸的主要致病菌，也是兔子的常見(jiàn)致病菌，符合臨床實(shí)際情況；（3）本研究可以對(duì)胸腔導(dǎo)管進(jìn)行研究，為臨床研究細(xì)菌和胸腔引流管之間的密切關(guān)系提供了可能。盡管實(shí)驗(yàn)中所使用的金黃色葡萄球菌是強(qiáng)力致病菌，但在不使用抗生素的情況下，兔子依然能夠存活并形成膿胸。

在最初的試驗(yàn)中，筆者嘗試了在胸膜間隙放置引流管，然后將其固定在肩胛區(qū)的皮下組織中，但是失敗了。一方面，可能形成大量纖維蛋白隔膜，阻礙積液的引流，也阻止穿刺傷口的愈合，增加污染機(jī)會(huì)，使兔子死亡率增加；另一方面，體外留置引流管不利于兔子管理，兔子可撕咬導(dǎo)管而造成導(dǎo)管脫出，而固定兔頭影響其正常生活導(dǎo)致兔子更易死亡。因此，實(shí)驗(yàn)中筆者將引流管完全置入胸腔中以模擬胸腔引流導(dǎo)管長(zhǎng)時(shí)間留置，觀(guān)察引流管在膿胸胸腔中的情況。

已有研究表明，在長(zhǎng)期留置于體內(nèi)的替代性治療移植物中存在大量的細(xì)菌[19]，且在多數(shù)動(dòng)物模型中均已證實(shí)了這一點(diǎn)，這與本研究的結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)處死兔子后，筆者將胸腔內(nèi)導(dǎo)管取出，用生理鹽水沖洗導(dǎo)管內(nèi)外表面。然后，取部分導(dǎo)管剪碎放入生理鹽水中，將其震蕩，用該生理鹽水進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)震蕩后液體中可培養(yǎng)出大量細(xì)菌，證明了膿胸中金黃色葡萄球菌能夠黏附在導(dǎo)管上生長(zhǎng)。在臨床上，部分進(jìn)行閉式胸腔引流治療的患者會(huì)出現(xiàn)遷延不愈，甚至發(fā)展為慢性膿胸的情況，這除了與患者自身的生理狀況和耐藥金黃色葡萄球菌等有關(guān)外，是否也與金黃色葡萄球菌能夠在導(dǎo)管表面黏附生存有關(guān)，這一點(diǎn)尚未有明確報(bào)道。對(duì)于膿胸中引流管表面存在的細(xì)菌能夠存活多久，筆者進(jìn)行了一次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)即使在造成膿胸后60 d導(dǎo)管表面仍然存在有大量細(xì)菌，而此時(shí)胸腔內(nèi)部感染已基本被清除了。提示引流管可能為細(xì)菌提供了一個(gè)庇護(hù)所，使細(xì)菌能夠躲避宿主的免疫清除，進(jìn)而長(zhǎng)期存活于宿主體內(nèi)。

最后，筆者利用該兔膿胸模型研究了尿激酶和DNase I 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兔膿胸的影響。自1940年以來(lái)，針對(duì)膿胸的纖溶治療一直被提倡，并且仍然是當(dāng)今膿胸治療武器的一部分[20]。然而，2005年的一項(xiàng)研究評(píng)估了鏈激酶治療膿胸的臨床相關(guān)終點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鏈激酶在死亡率、手術(shù)率、影像學(xué)結(jié)果或住院時(shí)間方面均無(wú)益處[21]，而另一項(xiàng)在兒科膿胸患者中進(jìn)行的隨機(jī)研究表明，采用尿激酶纖溶酶原激活劑進(jìn)行胸膜腔內(nèi)纖溶治療的效果與胸腔鏡一樣好[22]。另一方面，DNase I 可以減少細(xì)胞外DNA 和其它細(xì)菌成分，從而降低胸腔積液的黏度[15]，常與纖溶酶原激活劑聯(lián)合用于治療膿胸。國(guó)外關(guān)于纖溶酶原激活劑聯(lián)合DNase 治療膿胸已有較多報(bào)道，通常應(yīng)用的是阿替普酶。因此，本實(shí)驗(yàn)選用了尿激酶，觀(guān)察其聯(lián)合DNase 治療兔膿胸的療效。本研究發(fā)現(xiàn)這兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用確實(shí)可以有效的減少纖維蛋白的沉積和胸膜粘連。然而，遺憾地是，聯(lián)合應(yīng)用尿激酶和DNase I似乎并未能有效減少胸膜腔留置導(dǎo)管上的細(xì)菌量，對(duì)膿胸相關(guān)的胸腔積液也未發(fā)現(xiàn)明確的作用意義。在本次膿胸模型中，尿激酶聯(lián)合DNase治療觀(guān)查到了明顯的胸膜厚度和炎癥減輕，然而Idell等[13]關(guān)于尿激酶治療膿胸的研究認(rèn)為尿激酶并不能使膿胸相關(guān)的胸膜厚度和胸膜皮減輕。筆者認(rèn)為造成這種差異的可能原因是治療方案并不完全相同，筆者采用的是尿激酶聯(lián)合DNase，而Idell等[13]單用尿激酶治療。

本研究存在的局限性：本研究模型與多數(shù)膿胸患者的通常情況不同，因?yàn)榇蠖鄶?shù)膿胸患者都具有潛在的肺炎，而在本模型中，原發(fā)感染在胸膜腔內(nèi)；本研究動(dòng)物樣本量較少；本次實(shí)驗(yàn)僅對(duì)尿激酶和DNase I的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了研究，未設(shè)置單用尿激酶或DNase I 的對(duì)比研究，這兩種藥物對(duì)膿胸的具體效用仍有待研究。

綜上所述，通過(guò)向新西蘭兔胸腔中直接注入高濃度金黃色葡萄球菌懸浮液，并植入引流管，成功建立了金黃色葡萄球菌新西蘭兔膿胸模型，并證實(shí)了引流管上存在大量細(xì)菌；早期尿激酶和DNase I聯(lián)合干預(yù)膿胸可以有效減少胸膜腔內(nèi)纖維蛋白沉積和粘連。