基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究甘草查爾酮A抗鼻咽癌的潛在靶點和作用機(jī)制*

楊萌哲 ，徐 寧，成南南，郭興喆 ,白先愚，呂安喬，楊建宇，黃元姣，△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.生物分子醫(yī)學(xué)研究實驗室；2.生命科學(xué)研究院，南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是起源于鼻咽的上皮，由鼻咽黏膜內(nèi)膜引起的惡性腫瘤。廣東、廣西的鼻咽癌發(fā)病率和死亡率高于中國其他地區(qū)[1]。鼻咽癌早期僅以放射治療作為主要治療方法，而局部晚期疾病則需要化學(xué)療法與放射療法相結(jié)合進(jìn)行治療[2]。但是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是一個問題[3]。尋求治療新途徑，是有效控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。其中，通過中藥輔助化療成為近年來鼻咽癌高發(fā)地區(qū)探索鼻咽癌治療的新方向。中藥單體是從傳統(tǒng)的中草藥中提取的有效活性成分。中藥單體以其高效、毒性小、價格低廉等優(yōu)點，被作為潛在的治療藥物進(jìn)行廣泛研究[4]。甘草查爾酮A（licochalcone A，LCA）是一種從甘草根部中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗血管生成的作用[5-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究的一個新領(lǐng)域，可以利用現(xiàn)有的多種數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)分析方法，探討治療性化合物在疾病中的作用機(jī)制[9-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過建立藥物－成分－靶點網(wǎng)絡(luò)以預(yù)測藥物有效成分從而揭示藥物與疾病的相互關(guān)系，已逐漸成為現(xiàn)代中藥研究的熱門工具[11]。這種理論方法可以快速準(zhǔn)確的區(qū)分潛在的藥物－靶點相互作用，為實驗研究提供支持證據(jù)[12]。研究表明，LCA 降低NPC 細(xì)胞活力，并通過JNK/p38 途徑誘導(dǎo)NPC 細(xì)胞凋亡[13]。本研究將從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度分析LCA 治療NPC 的潛在核心靶點和生物學(xué)功能，驗證LCA抗NPC的分子機(jī)制，為LCA的開發(fā)利用及NPC的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 LCA潛在靶點的獲取 為了預(yù)測LCA的作用靶點，登陸PubChem 分子庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[14]，檢索選擇species為Homo sapiens，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，進(jìn)行預(yù)測。下載LCA 的3D-SDF 格式，再導(dǎo)入Swisstarget 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），篩選Probability＞0，得到預(yù)測靶點。接著，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uploadlists/）進(jìn)行靶點蛋白和基因信息校正，得到相應(yīng)的基因名稱數(shù)據(jù)庫，方便進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

1.2 NPC 相關(guān)基因靶點的獲取 通過GeneCards網(wǎng)站（https://www.genecards.org/）檢索靶點，輸入關(guān)鍵詞為“nasopharyngeal carcinoma”，獲得與鼻咽癌相關(guān)基因的靶點。

1.3 篩選LCA靶點和NPC相關(guān)的共同靶點 將獲得的NPC 相關(guān)基因和LCA 作用靶點輸入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）,篩選出共同靶標(biāo)基因，作為LCA對NPC的潛在作用靶標(biāo)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) STRING（https://string-db.org/，版本10.5）數(shù)據(jù)庫是提供有關(guān)蛋白質(zhì)預(yù)測和相互作用的信息，用于分析蛋白質(zhì)的PPI[15]。將LCA對NPC潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類（human sapiens），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出結(jié)果。

1.5 關(guān)鍵靶點生物功能注釋及通路分析 基因本體（gene ontology,GO）富集分析包括生物過程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和細(xì)胞成分（celluar component,CC）。我們利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 富集分析，以進(jìn)一步研究41 個共同靶點的生物學(xué)過程。通過京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析（https://www.kegg.jp/）對通路進(jìn)行分類，獲得了有關(guān)LCA治療NPC關(guān)鍵靶點的相關(guān)途徑，篩選出LCA治療NPC的信號通路。

1.6 建立“藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape-v3.6.1 軟件構(gòu)建“藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型，其中“節(jié)點”代表化合物或靶標(biāo)，“邊”代表相互作用的關(guān)系，對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，以確定網(wǎng)絡(luò)模型中的相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 LCA 潛在靶點的獲取 通過PubChem 分子庫獲得LCA 的3D 結(jié)構(gòu)，見圖1。Swisstarget 數(shù)據(jù)庫篩選出LCA靶點以及利用Uniprot數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行進(jìn)一步校正，建立藥物－靶點數(shù)據(jù)庫。按照Probability排序，選取前10個基因名稱和靶點，見表1。

2.2 LCA 靶點和NPC 相關(guān)的共同靶點 從Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫獲得與NPC 相關(guān)的基因靶點共有1 786 個。將1 786 個NPC 相關(guān)基因與91 個藥物靶點基因通過Venny2.1映射篩選出共同靶點41個，確定為LCA治療NPC的潛在靶點基因，見圖2。

圖1 LCA的3D結(jié)構(gòu)

表1 LCA排名前10的潛在靶點

圖2 LCA與NPC靶點韋恩圖

2.3 LCA 和NPC 相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò) 從系統(tǒng)的角度來看，PPI 網(wǎng)絡(luò)是了解復(fù)雜疾病中多種蛋白質(zhì)的多因素功能的基礎(chǔ)。因此，構(gòu)建了LCA和與NPC相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。PPI包含41個節(jié)點，其中每個節(jié)點表示一種蛋白質(zhì)，每條邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。其中RAF1、BRAF、RPS6KB1這些靶點有較多的相互作用，這也為進(jìn)一步研究各靶點之間的功能提供依據(jù)。

2.4 GO功能富集分析 GO富集分析包括BP、CC和MF 3個部分，說明LCA發(fā)揮抗腫瘤的作用，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，BP中富集靶點較多的有蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）等。CC中富集靶點較多在細(xì)胞質(zhì)膜（cytoplasm）等。MF中富集靶點較多在蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）以及ATP結(jié)合（ATP binding）等。

圖3 LCA治療NPC 的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG 功能富集分析 將41 個共同靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，利用KEGG分析得到65個信號通路。從圖5 可見，關(guān)鍵靶點主要富集在癌癥相關(guān)信號通路(pathways in cancer)、酒精通路（alcoholism）、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)以及癌癥微小核糖核酸表達(dá)通路(microRNAs in cancer)等。其中癌癥相關(guān)信號通路共有11 個靶基因；酒精通路共有8 個靶基因；MAPK 信號通路共有8個靶基因；癌癥微小核糖核酸表達(dá)通路共有7 個靶基因。

2.6 “藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型 構(gòu)建“藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型，表明LCA與NPC 靶點之間的相互作用以及關(guān)鍵途徑，如圖6 所示，41 個左側(cè)節(jié)點代表NPC 的靶點，20 個右側(cè)節(jié)點表示化合物作用的關(guān)鍵通路。涉及的關(guān)鍵基因主要有：MAPK14、MAPK10、MAPK1以及RAF1等。

圖4 LCA治療NPC的GO功能富集分析

圖5 LCA治療NPC的KEGG富集分析

圖6 “藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型

3 討論

本研究篩選出NPC 與LCA 的共同作用靶點共41 個。GO 功能富集分析顯示，生物過程和功能主要富集在蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過程的負(fù)反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞質(zhì)以及分子功能蛋白質(zhì)黏合等。研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化可以協(xié)調(diào)多種細(xì)胞功能，例如細(xì)胞生長，分化和凋亡。但磷酸化途徑的改變會導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，尤其是癌癥[16]。組蛋白H3 在絲氨酸10 位點（Ser10）的磷酸化，具有致癌作用，并直接調(diào)控表皮細(xì)胞生長因子或組織型纖溶酶原激活劑,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖[17-18]。在多種結(jié)直腸癌細(xì)胞中也觀察到有絲分裂組蛋白H3 Ser10 磷酸化增強(qiáng)[19]。有研究表明，組蛋白H3 磷酸化的增加可能是鼻咽癌發(fā)病過程中的重要事件，促進(jìn)了鼻咽上皮的惡性轉(zhuǎn)化[20]。

通過KEGG 功能富集分析表明LCA 抗NPC 作用的通路主要有癌癥相關(guān)信號通路、酒精通路、MAPK 信號通路以及癌癥微小核糖核酸表達(dá)通路等。其中，富集最多的是癌癥相關(guān)信號通路，包括p53 信號通路、NF-κB 信號通路、Ras-Raf 信號通路、Wnt 信號通路以及TGF-β 信號通路等。p53 是一種眾所周知的抑癌基因，被定義為“癌癥特征的潛在過程的協(xié)調(diào)者”。它在預(yù)防癌癥發(fā)展中起著重要的作用。p53 蛋白是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可被多種應(yīng)激信號激活，通過調(diào)控DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡來防止遺傳損傷的積累[21]。研究表明，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白PBK 通過抑制p53 的表達(dá)抑制DNA 損傷檢查點，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[22]。NF-κB通路在鼻咽癌研究進(jìn)展中起著十分重要的作用。NF-κB異常活化可能是腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過程中主要的抗凋亡途徑之一[23]。有研究表明，纖維連接蛋白1（FN1）通過NF-κB 通路中的p65 途徑調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞凋亡[24]。NKILA（一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA）通過NF-κB通路調(diào)控鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，在鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[25]

“藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)圖顯示關(guān)鍵基因主要有：MAPK14、MAPK10、MAPK1、RAF1等。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，包括Ras/ERK 信號通路、JNK 信號通路、p38信號通路3 種信號通路，主要在細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、細(xì)胞遷移、有絲分裂、分化和凋亡中的調(diào)控起作用[26-28]。MAPK14 基因表達(dá)p38α 的蛋白質(zhì)，p38α 主要由細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)調(diào)控和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)介導(dǎo)[29]。有研究結(jié)果表明，LCA 通過JNK/p38 途徑誘導(dǎo)NPC 細(xì)胞凋亡[13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析也證實了MAPK14是LCA抗NPC的關(guān)鍵靶點。此外，Raf 在癌癥中的進(jìn)展和促進(jìn)癌癥生長中的重要性已得到了公認(rèn)[30]。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度成功實現(xiàn)了LCA 和NPC 的藥效關(guān)系構(gòu)建以及可視化目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，并且驗證了已有實驗的有效性。因此，將古老的中醫(yī)藥與新興的網(wǎng)絡(luò)技術(shù)聯(lián)系起來，將為發(fā)現(xiàn)中藥藥理作用、活性成分和生物標(biāo)志物，揭示潛在的作用機(jī)制提供新穎的方法和機(jī)會[31-32]。