基質分散固相萃取-UPLC-MS/MS測定煙草中馬來酰肼殘留量

張海燕 陶曉秋 韶濟民 靳冬梅 龐 夙 熊 巍

(四川省煙草質量監督檢測站，成都 610041)

馬來酰肼又名抑芽丹，是一種植物生長調節劑，煙草生產中常用其抑制煙草側芽生長，國外應用比較廣泛。由于其在煙草大田生長期的多次施用，從而會導致其在初烤煙葉中的殘留, 煙葉中馬來酰肼的殘留會對吸煙者產生健康風險，國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)在2013年修訂的煙草農藥指導性殘留限量名單[1]中，馬來酰肼的指導限量為80 mg/kg。

煙草中馬來酰肼殘留量的分析方法主要有分光光度法(ISO4876-1980)[2]，高效液相色譜法(HPLC，YC/T405.5—2011)[3]、氣相色譜法(GC)和膠束液相色譜(MLC)。煙草行業目前應用較為廣泛的測定煙草中馬來酰肼殘留量的方法為HPLC-UV法(YC/T405.5—2011)，該方法對樣品采用鹽酸溶液加熱回流萃取，用C18固相萃取小柱凈化，HPLC-UV測定。該標準方法的檢出限較高，且采用外標法定量，對煙草中低濃度馬來酰肼殘留量的檢測準確度相對較低，容易出現假陽性檢出現象。陳曉水[4]等建立了一種鹽酸溶液加熱回流萃取后經水相濾膜過濾，氘代同位素內標定量，LC-MS/MS法測定煙草中馬來酰肼的方法，方法的檢測靈敏度顯著提高，但是分析時間為30 min，大量樣品的檢測會受到一定的限制。超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC)[5-7]具有快速準確、靈敏度高等優點，適合于煙草樣品中低殘留量的馬來酰肼的快速準確測定。

本實驗采用加熱回流法提取煙葉中的馬來酰肼，分散固相萃取法凈化樣品，UPLC-MS/MS測定，氘代內標定量，適合于準確快速分析煙草中馬來酰肼的殘留量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀(Xevo TQ，美國Waters公司)，配備電噴霧電離源(ESI)；智能型加熱套(北京中興偉業儀器有限公司)；渦旋振蕩器(Vortex Mixer 230 V-EU 振蕩器，美國Labnet 公司)； AE200 電子分析天平(感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo 公司)；Cascada ANMK2 純水儀(美國Pall 公司)；0.45 μm 水相針式濾器(上海安譜科學儀器有限公司)；單孔道移液器(20～200 μL)、電動分液器(德國Eppendorf 公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純，美國Thermo-Fisher公司)；馬來酰肼標準品(化學純度：≥98.5%，德國Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)，馬來酰肼-d2標準品(化學純度：98%，同位素純度：98.9%德國Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)；N-丙基乙二胺(PSA)購自安捷倫公司(美國)，石墨化炭黑、弗羅里硅土，鹽酸(分析純，西隴科學股份有限公司)；甲酸(HPLC級，濃度為49～51%，德國Sigma公司)；水為超純水。無農藥殘留煙葉樣品由國家煙草質量監督檢驗中心提供。

1.3 標準溶液配制

標準溶液：稱取10 mg馬來酰肼標準品，精確至0.0001g, 用超純水溶解并定容至10 mL，制得1.0 mg/mL標準儲備液。取一定量的所述標準品儲備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL標準工作液。

內標溶液：準確配置1.0 mg/mL馬來酰肼-d2內標標準儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中。取一定量的所述內標儲備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL內標工作液。所有的儲備液和工作液于冰箱4℃保存，使用前將其恢復到室溫。

1.4 樣品的提取

稱取5 g試樣于圓底燒瓶中，精確至0.01g。加入50 mL 4 mol/L的鹽酸提取液，250 μL氘代內標工作液(200 μg/mL)，適當振搖，使煙末分散與鹽酸溶液混合均勻。將燒瓶放置于加熱套中，裝上球形冷凝管，將加熱套溫度設置為180℃左右，加熱回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球處，回流穩定后開始計時，回流1小時。回流結束后，關閉加熱套或油浴鍋電源，冷卻至室溫。

1.5 分散固相萃取凈化

移取1mL上清液于旋蓋離心管，加入25 mgPSA吸附劑，漩渦振蕩混合2 min，2000 r/m，吸取上清液經水相濾膜過濾，移取500μL濾液，并用超純水稀釋定容到1mL后待測。

1.6 LC-MS/MS條件

1.6.1 LC條件

色譜柱:Atiantis UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1mm，1.8 μm； Waters公司)；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液(v/v)， B為0.1%的甲酸乙腈溶液(v/v)；流速0.45 mL/ min；柱溫45 ℃；進樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，100%A；2～2.8 min，100%A～30%A；2.8～3.0 min，30%A～20%A；3.0～4.0 min，20%A～5%A；4～6 min，5%A；6～6.1 min，5%A～100%A；6.1～8 min，100%A。

1.6.2 MS/MS條件

電噴霧離子源；正離子掃描模式；噴霧電壓(IS)：3.0 kV；離子化溫度500 ℃；霧化氣流量：800 L/Hr; 錐孔氣(cone)流量50 L/Hr; 碰撞氣流量為0.15 ml/ min; 碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣; 駐留時間為100 msec，正離子MRM模式采集。監測離子對及其相應的碰撞能量(CE)見表1。

表1 多反應監測模式下馬來酰肼及其氘代內標的部分質譜參數

2 結果

2. 1 標準曲線和檢出限

為了減少基質效應帶來的離子抑制或增強作用對定量分析的影響，采用空白樣品提取液配制一系列基質標準工作溶液。分別移取標準工作液5 μL，12.5 μL，50 μL，125 μL，250 μL和500 μL標準工作液到7個10mL棕色容量瓶中，每個容量瓶移入25 μL內標工作液(200μg/mL)，配制成溶劑配制標準工作曲線。基質添加標準曲線的配制方法為分別移取500 μL每個標準工作曲線溶液于7個1.8mL旋蓋色譜瓶，加入500 μL空白煙葉樣品萃取液，用超純水定容至1mL，馬來酰肼的線性范圍50 ng/mL-5000 ng/mL。分別對這些標準溶液進行UPLC-MS/MS分析，并對各標樣峰面積與內標的峰面積的比值(y)和其濃度(x)進行線性回歸分析，得到標準曲線。

以3倍信噪比確定方法的檢出限，各種煙葉基質中馬來酰肼的LOD范圍為0.624～987 ng/mL，混合標準品及加標樣品的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 1個曬煙樣品的選擇離子流色譜圖

2.2 基質效應

基質效應一般是通過基質添加標準曲線和溶劑空白標準曲線的斜率來評價[8]。一般認為，ME值在85% ～115% 之間不存在基質效應。具體計算公式見式(1)。

ME= ( 1-X2 /X1 ) ×100%

(1)

其中，ME代表基質效應，X1 和X2 分別代表溶劑空白標準曲線和基質添加標準曲線的斜率。結果發現，煙葉基質對曬煙和烤煙中馬來酰肼的基質效應分別為88.50%和88.47%( 根據表2 標準曲線數據計算)，可見煙葉基質對馬來酰肼的響應強度產生了很大的抑制作用，但基質添加標準曲線仍可獲得與溶劑空白標準曲線相似的線性響應( r2，見表2) 。因此本實驗采用基質添加標準曲線對目標分析物進行定量，以避免基質效應對定量結果的影響。

表2 馬來酰肼的標準曲線及線性關系

2.3 方法的回收率及重復性

選取不含馬來酰肼的烤煙和晾曬煙葉樣品，向不同類型的煙葉樣品中添加標準溶液，分別按照“樣品的提取和凈化”的方法處理樣品后上機檢測，然后分別計算烤煙和晾曬煙樣品中馬來酰肼的回收率。每個水平測5次，得出平均回收率(表3)。如表3所示，馬來酰肼平均回收率在105.9～111.8%之間，RSD范圍為3.3%～9.1%。結果表明，方法的重復性和回收率均符合歐盟委員會[9]“食品和飼料中農殘分析的質量控制和方法評價指導文件”的相關要求(回收率在70%～120%，重復測定RSD<20%)

表3 煙草中馬來酰肼的回收率和精密度(n=5)

3 討論

3. 1 色譜質譜條件的優化

采用流動注射方式進樣進行母離子掃描，確定最大響應值的母離子，在子離子掃描(PI)模式下，調整CE找到該母離子對應的子離子，其中響應最高的錐孔電壓和碰撞能量見表1。

馬來酰肼在反相柱上有較好的保留行為，因此本實驗選取了UPLC HSS T3，Hypercarb Porous Graphitic Carbon，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等色譜柱優化條件發現，采用UPLC HSS T3柱分離的峰性尖銳，對稱，分離度明顯優于其它色譜柱，能夠將馬來酰肼和基質中的干擾物完全分離，適合于不同類型的煙葉中馬來酰肼殘留量的測定。圖1是1個馬來酰肼有檢出的曬煙樣品的MRM色譜圖。

本實驗選取在水中加入甲酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)、乙酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)或者甲酸銨(5 mmol/L和10 mmol/L)作為流動相A進行優化色譜條件。結果表明，在水中添加0.1%的甲酸作為流動相A時分析物的質譜信號最強，峰形最好，所以最終選擇0.1%甲酸水溶液作為流動相A。梯度洗脫程序僅需8 min，與標準方法(20 min)相比顯著縮短了分析時間。

3.2 樣品凈化條件的優化：

分散固相萃取技術具有快速、高效和廉價等優點，被廣泛運用于殘留檢測的前處理中。它主要通過非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質干擾成分，進而達到凈化的效果[10]。常用的吸附劑材料有無水MgSO4、弗羅里硅土、PSA 和石墨化碳黑(GCB)。本實驗考察了PSA、石墨化炭黑、弗羅里硅土幾種凈化劑對煙草中馬來酰肼提取效率的影響。

由圖2中結果可見，PSA對馬來酰肼提取效率最高，因為PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團，主要作用力是極性相互作用及弱陰離子交換作用，可有效去除樣品中的有機酸、脂肪酸和糖等干擾物，但對分子結構中帶有羧基的化合物有一定的保留作用，所以本實驗選用PSA作為前處理的凈化劑。

圖2 不同凈化劑對煙草中馬來酰肼的提取效率

3.3 實際煙葉樣品檢測與標準方法對比

利用該方法與標準方法(YC/T405.5-2011)同時對20個煙葉樣品進行檢測，并且對兩種方法的檢測結果進行相關性分析，如圖3。

圖3 UPLC/MS-MS法與標準方法檢測馬來酰肼殘留量的相關性

由圖3中相關性結果可以看出，本方法與標準方法檢測煙葉中馬來酰肼殘留量的相關系數R2=0.9894，則r=0.9947(r0.01=0.561，n=20)。r> r0.01，表明兩種分析結果達到了極顯著的正相關，其趨勢線的斜率為0.998，接近1，兩種方法的測定值無顯著差異，具有較好的一致性。

4 結論

建立了煙草中馬來酰肼殘留量的準確快速分析方法，采用基質分散固相萃取處理煙葉樣品，氘代內標定量，UPLC-MS/MS分析檢測，總分析時間為8 min，各種煙葉基質中馬來酰肼的檢出限范圍為0.624～987 ng/mL，加標回收率為105.9%～111.8%，相對標準偏差為3.3%～9.1%。本實驗田建立的方法具有針對性強，檢測時間短和靈敏度高的特點，能夠很好的應用于煙草中馬來酰肼殘留量的快速分析檢測。