華蟾素片對CT26結腸腺癌誘導惡病質小鼠肌肉萎縮的影響

林毅，王振飛，肖靜

福建中醫藥大學附屬人民醫院肛腸三科，福建福州350004

進行性骨骼肌流失與消耗是癌性惡病質(cancer cachexia，CC)最典型、最復雜的特征[1]。它常常導致患者的體重下降、活動能力減退等，最終導致免疫功能低下，治療耐受力下降，縮短了總生存時間[2]。研究表明，腫瘤誘導的肌蛋白降解密切相關的是泛素蛋白連接酶E3，而其中最重要的標記物是肌萎縮F-box蛋白(muscle atrophy F-box，MAFbx)和肌肉環指蛋白-1(muscle ring finger 1，MuRF-1)[3]。該實驗建立CT26結腸腺癌誘導的惡病質小鼠模型，在華蟾素片干預與否下，檢測和對比凈體質量、心肌、腓腸肌和附睪脂肪的質量、腓腸肌組織中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表達[4]，來探討華蟾素片對惡性腫瘤惡病質引起的骨骼肌萎縮的治療價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型建立

清潔級雄性健康小鼠24只，6～8周齡，體重18～22 g。小鼠CT26腺癌細胞經培養媒介（10%小牛血清、1%青霉素、100μg/mL鏈霉素組成）培養，每3～4天傳代1次，3代后收集，經磷酸鹽緩沖液沖洗（PBS），制成含腫瘤細胞的混懸液。將5×106(0.2 mL PBS)個細胞接種于16只小鼠前腋窩皮下。

1.2 藥物、試劑與儀器

華蟾素片（國藥準字Z34020272）。MAFbx(AB3353，1 mg/mL)，MuRf-1(RS1328R，1 mg/mL)；Trizol試劑盒(LGTZ001）。RT-PCR試劑盒(No.121256)。儀器：2720 PCR擴增儀；蛋白電泳儀，DYCZ-26B。

1.3 動物模型建立、分組與給藥

24只小鼠按照隨機數字表法分為3組：正常組（NN）、單純惡病質組（CC）、實驗組（EG），每組8只。待動物模型建立成功后，實驗組予以藥物干預：華蟾素片3 g/L溶于生理鹽水中，每只實驗組小鼠灌喂量為0.1 mL/g，正常組及單純惡病質組灌喂等量生理鹽水，2次/d，連續灌喂14 d。

1.4 觀察指標

觀察小鼠進入惡病質狀態的表征，實驗前后記錄每只小鼠的凈體質量（總體質量減去腫瘤質量），檢測實驗后每只小鼠心臟、腓腸肌、附睪脂肪的質量。RTPCR法檢測MAFbx、MuRF-1 mRNA表達：Trizol法提取小鼠腓腸肌RNA；采用β-actin基因，經數據庫獲得基因序列，采用Primer-Expression軟件輔助設計[5]。

1.5 統計方法

采用SPSS 18.0統計學軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 凈體質量變化及心肌、骨骼肌、附睪脂肪比較

實驗前后的凈體質量對比,單純惡病質組與實驗組均顯著下降，差異有統計學意義(t=5.394、2.832，P＜0.05)；兩組對比，單純惡病質組小鼠凈體質量的下降更加明顯，差異有統計學意義(t=4.055，P＜0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠凈體質量比較[（±s），g]

表1 兩組小鼠凈體質量比較[（±s），g]

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實驗后骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質量的對比，惡病質組小鼠的下降更加明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質量的比較[（±s），g]

表2 兩組小鼠骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質量的比較[（±s），g]

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2.2 腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達

與正常組比較，單純惡病質組、實驗組小鼠腓腸肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA表達量顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；但與單純惡病質組比較，實驗組小鼠腓腸肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表達量均顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達比較[（±s），g]

表3 兩組小鼠腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達比較[（±s），g]

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3 討論

惡性腫瘤已成為威脅全人類生命及健康的最重要疾病之一。到2035年，罹患惡性腫瘤的人數將增至2 400萬，將成為全球最大的公共衛生問題[6]。惡性腫瘤發展到中晚期，常伴發腫瘤誘導的惡病質，據統計，約有50%的晚期和約80%的終末期患者會出現該癥狀，約22%的癌癥患者的直接死因是惡病質，而不是腫瘤本身[7]。國際惡病質大會對此達成了共識：它是多種因素介導的機體骨骼肌質量持續性下降，伴或不伴有脂肪質量的下降，并因此導致多器官功能障礙直至衰竭的臨床綜合征[8]。

經過近些年的研究認為，癌性惡病質導致骨骼肌質量與體重的下降，有至少3條獨立的途徑：①溶酶體蛋白酶系統途徑；②鈣依賴的蛋白酶系統途徑；③ATP-泛素-蛋白酶體途徑。其中，泛素-蛋白酶體降解途徑（UPP途徑）是其重要途徑，它由泛素(Ub)、泛素相關酶（活化酶E1、耦聯酶E2、蛋白連接酶E3）和蛋白酶體三部分組成。泛素蛋白連接酶E3是途徑激活的關鍵酶，經過催化形成降解信號，使蛋白酶體識別靶蛋白，產生骨骼肌降解。并且它決定了該途徑的特異性和降解速率[9]。MAFbx、MuRF-l是蛋白連接酶E3的重要組分，特異性表達在骨骼肌細胞。在肌萎縮的發生發展過程中被顯著激活，使底物蛋白泛素化，加速肌蛋白被轉運后在蛋白酶體中降解，產生進行性的肌萎縮。在該基因去除的實驗動物體內，肌肉萎縮的發生率下降。因此，MAFbx和MuRF-l基因被認為可能是控制骨骼肌蛋白分解的正調節關鍵基因[10]。

近年來，中醫藥在治療惡性腫瘤的基礎研究和臨床實驗中均取得重大的進展。中醫認為癌性惡病質系因癌腫久病，從而耗傷人體的陰、陽、氣、血所致，中醫藥治療可以達到清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結的作用。尤其在中晚期惡性腫瘤的治療中，起到了增效減毒、提高機體免疫力、抑制腫瘤生長、改善臨床癥狀、提高生活質量的作用[11]。華蟾素是由中華大蟾蜍的皮，經多道工序制成的口服中成藥，它的有效生物活性成分為吲哚生物堿和甾體強心苷等[12]。該成分可提高樹突狀細胞表面分子的表達水平，影響IL-6、TNF-α等細胞因子的分泌，因而增強其抗原呈遞功能，抑制誘導腫瘤細胞凋亡，提高免疫力，減緩癌性惡病質的進展，因而華蟾素被廣泛應用于惡性腫瘤的臨床輔助治療[13-14]。

在臨床中，謝明智等[15]發現華蟾素在肝癌引起的癌性惡病質的治療中，可明顯改善患者的營養狀況。為進一步論證華蟾素在大腸癌惡病質治療中效果，該實驗通過建立癌性惡病質的動物模型，在華蟾素片的灌喂干預下，實驗組小鼠質量由（19.98±1.08）g下降至（18.86±0.63）g，而單純惡病質組小鼠的體重由（20.10±1.21）g下降至（17.39±0.75）g，盡管兩組小鼠質量均顯著下降(t=5.394、2.832，P＜0.05)。但兩組比較發現，單純惡病質組小鼠凈體質量的下降更加明顯(t=4.055，P＜0.05)。為了更加確切地辨別骨骼肌組織的變化，統計了實驗后心肌組織的質量分別為單純惡病質組（113.08±12.23）mg、實驗組（133.04±11.57）mg；腓腸肌組織的質量分別為單性惡病質組（228.84±16.22）mg、實驗組（248.12±10.93）mg；附睪脂肪組織的質量分別為單純惡病質組（425.90±17.25）mg、實驗組（462.67±28.38）mg，三類指標的比較發現，在華蟾素的干預下，小鼠機體中重要肌肉組織的萎縮明顯改善(t=3.352、2.788、3.131，P＜0.05)。同樣，在實驗后的腓腸肌組織中MAFbx、MuRF-1 mRNA表達的對比中可以得到相同的結論，華蟾素能明顯緩解和改善大腸癌癌性惡病質小鼠的骨骼肌和重要臟器的肌肉萎縮程度，為進一步的臨床實踐提供了動物實驗基礎。