基因編輯治療原發性免疫缺陷病

劉珊 方姝煜 綜述 安云飛 審校

（重慶醫科大學附屬兒童醫院風濕免疫科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒童感染免疫重慶市重點實驗室，重慶 400014）

［中國當代兒科雜志，2021，23（7）：743-748］

一直以來，精準有效地編輯活細胞基因組DNA是生命科學和醫藥領域的主要目標。基因編輯技術提供了一種相對快速且簡單的方法，實現了對目標基因的刪除、替換和修改。隨著鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、規律間隔成簇短回文重復序列及其相關核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）等特異性人工核酸酶的出現，該技術逐漸發展為一套較成熟的體系，使得基因相關疾病得以更有效地治療和預防。原發性免疫缺 陷病（primary immunodeficiency disease，PID）是一類主要由單基因突變導致的免疫細胞發育或功能異常性疾病，免疫重建是根治的關鍵。基因編輯的出現為PID的治療提供了新選擇。本文將從基因編輯發展沿革入手，概述ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、堿基編輯和先導編輯，并簡述基因編輯在PID中的應用。

1 基因編輯

基因編輯，一種通過刪除、插入或替換基因組的某個片段或特定堿基使基因組發生特定變化的分子技術，目前廣泛用于生物學研究中［1］。起初該技術通過產生DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrand breaks，DSB）激活非同源末端連接及同源定向修復等細胞內源性修復機制發揮作用。前者在斷裂位點隨機引入插入缺失，后者則以供體DNA為模板誘導可預測的基因表達［2-3］。在修復過程中，兩種途徑同時發生并且相互競爭，但多數情況下以非同源末端連接為主，因此編輯過程中不可避免出現副產物。對于已知的致病性突變而言，糾正目標位點的突變才是治療的最終目的。因此研究者后續開發出無需產生DSB的堿基編輯和先導編輯，掀起了基因編輯技術應用的新篇章。

1.1 ZFN

ZFN由鋅指蛋白介導的DNA識別域和源自海床黃桿菌的核酸內切酶FokⅠ介導的DNA切割域組成。通常，鋅指蛋白由ββα結構的鋅指串聯組成。其中，α螺旋能插入DNA雙螺旋的大溝，特異性識別靶鏈的3個連續核苷酸。FokⅠ可非特異性切割DNA，但需二聚體的形成。當ZFN二聚體反向識別位點相距6～8 bp時，FokⅠ切割靶位點產生DSB，激活內源性修復［4］。鋅指結合特性和效率受內部氨基酸和臨近鋅指結構的影響，這使ZFN的直接構建或篩選耗時耗力。此外，三聯體識別模式限制了可靶向范圍。并且基因組中存在多個與目標位點相似的序列，可成為額外的靶點導致脫靶編輯。但不可否認，ZFN作為開創性技術，為基因編輯在各領域的應用奠定了夯實的基礎。

1.2 TALEN

TALEN由轉錄激活因子樣效應物（transcription activator-like effector，TALE）介導的DNA結合域和FokⅠ介導的DNA切割域組成。TALE由重復單元串聯構成。重復單元除重復可變雙殘基（第12、13位氨基酸）不同以外，其余高度相似。1個重復可變雙殘基能特異性識別1個堿基。與ZFN相似，TALEN也有組件FokⅠ，但需要10～30 bp的間隔才能實現切割［5］。與ZFN相比，TALEN技術的DNA識別域長、識別單元不受臨近單元的影響、識別密碼簡單對應等特性，使得其識別序列更廣、設計更靈活。但是由于廣泛相同的重復序列導致TALE克隆困難，并且結合位點需以堿基T開始，這使得TALEN技術的應用受到限制。隨著“Golden Gate”分子克隆、高通量固相組裝和獨立連接克隆技術的出現，可快速設計裝配自定義TALE陣列，而無堿基識別限制的突變體克服了5'-T這一難題［6］。這使得TALEN技術成為基因編輯的有力工具。

1.3 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas系統是細菌、古菌的適應性免疫防御系統，通過RNA引導核酸切割來抵抗外來遺傳物質對自身的影響。該系統由單鏈向導RNA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9核酸內切酶組成。其中，sgRNA與靶序列互補配對，而Cas9識別緊鄰靶點的前間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并執行剪切功能［7］。其作用過程為：Cas9識別合適的PAM后DNA雙螺旋解開，sgRNA識別目標序列形成RNA-DNA異源雙鏈。此時R環形成，導致Cas9發生構象改變而激活剪切活性，對DNA進行切割產生DSB［8-9］。與前兩種編輯方法相比，CRISPR/Cas9系統使用更精準的堿基互補配對識別方式，組件sgRNA的構建也更簡單及節約成本。但CRISPR/Cas9系統存在PAM限制、脫靶切割及系統遞送障礙等限制。通過改變Cas9同源序列對比、蛋白結構和蛋白定向進化等方法突破PAM限制，擴大了可靶向基因范圍。同時突變體Cas9單切口酶（Cas9 nickase，nCas9）、雙sgRNA組合及截短的sgRNA則降低了脫靶率［10-11］。而通過尋找到更小的Cas9蛋白［12］或者將Cas9分裝為兩個載體［13］等方法增加了遞送可行性。這一系列策略大幅度提高了CRISPR/Cas9系統的應用價值。

1.4 堿基編輯

在人類已知的致病性突變中，單堿基突變高達58%，因此開發一種精準且高效糾正點突變的技術尤為重要［14］。堿基編輯由sgRNA、修飾的Cas9蛋白和脫氨酶組成，無需DSB、供體模板及同源定向修復，便能對點突變進行精準修復［15］。目前，堿基編輯可分為胞嘧啶堿基編輯系統（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯系統（adenine base editor，ABE），前者將靶點胞嘧啶（cytosine，C）替換為胸腺嘧啶（thymine，T），后者則將靶點腺嘌呤（adenine，A）替換為鳥嘌呤（guanine，G）［16］。其作用過程為：在sgRNA和修飾的Cas9蛋白作用下形成R環后，脫氨酶直接作用于R環中未與sgRNA互補的無序單鏈，將其編輯窗中目標堿基（C/A）脫氨為中間產物（C→U、A→I），進而通過DNA復制或修復轉變為目標產物（U→T、I→G）。

CBE最初僅由sgRNA、催化失活的Cas9（dead Cas9，dCas9）和大鼠胞嘧啶脫氨酶組成。為了提高編輯效率和降低副產物的生成，研究者加入破壞尿嘧啶堿基切除修復的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑及使用觸發胞內堿基錯配修復的nCas9［15］。此外，化膿性鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，spCas9）同源物和突變體、自然及突變進化的胞嘧啶脫氨酶的使用也可擴大CBE編輯范圍，同時增加精準度和效率。由于已知的腺嘌呤脫氨酶不能以DNA為底物對A進行脫氨，Gaudelli等［16］構建人工定向進化的腺嘌呤脫氨酶，與野生型腺嘌呤脫氨酶形成異二聚體，再與nCas9融合，這才開發出了ABE系統。ABE系統的改進也可以借鑒CBE系統優化策略，但ABE對除野生型spCas9外的Cas結構域兼容性比CBE低。在最近的研究中，Richter等［17］對腺嘌呤脫氨酶進行噬菌體輔助的非連續和連續進化解決了當前ABE對部分Cas蛋白的不兼容。在實際應用中，ABE系統編輯的副產物更少，其可能原因為胞內肌苷的切除比尿嘧啶的切除要慢很多。并且雙細胞胚胎注射進行全基因組脫靶分析可對脫靶編輯進行評估后顯示ABE脫靶率遠低于CBE［18］。這一系列優勢說明ABE系統更具臨床應用價值。堿基編輯開創了堿基轉換的先河，但不能實現堿基之間的顛換。而C→A/G的糖基化酶堿基編輯器［19］和靶序列雙堿基編輯器［20］，讓堿基編輯使用更寬廣。

1.5 先導編輯

先導編輯是一種“搜索并替換”的多用途且精確的基因編輯技術，無需DSB或DNA模板便能介導靶向刪除、插入和堿基間的替換［21］。先導編輯由向導RNA（prime editing extended guide RNA，pegRNA）及Cas9-逆轉錄融合蛋白復合體組成。與原始sgRNA不同，pegRNA的3'端有兩個功能區，一個為引物結合位點可起始逆轉錄；另一個是逆轉錄模板可實現基因修飾［22］。Cas9蛋白為切割含PAM的DNA鏈的nCas9，其作用機制為：目標序列連接后，nCas9切割含PAM的DNA鏈，其靶鏈3'斷裂端與pegRNA互補后，啟動逆轉錄；隨后未被修飾的5'斷裂端被切除，經DNA連接酶連接斷端便實現了精準編輯。Anzalone等［21］通過使用逆轉錄酶突變體及增加sgRNA剪切非編輯鏈觸發細胞錯配修復途徑等方法將先導編輯系統進化至第3代。為了最佳編輯效率，關鍵組件pegRNA的組裝除根據既往經驗選擇合適長度的引物結合位點和逆轉錄模板外，還需考慮其他因素［23］。

先導編輯原則上可糾正89%人類疾病相關的已知遺傳變異，并且與CRISPR/Cas9系統相比，在同樣的編輯位點先導編輯展現出更低的脫靶率。同時，先導編輯介導所有堿基間的替換，補充了堿基編輯的不足。但仍需要解決一些問題，比如：細胞狀態和細胞類型對該系統編輯效率的影響，目標產物和副產物編輯的DNA修復機制需深入了解，并且體內應用先導編輯工具的遞送策略需進一步開發［23］。

2 基因編輯在PID中的應用

PID是一類影響免疫系統發育和/或功能的異質性單基因遺傳病，目前分為10類共430種［24］。PID可導致宿主免疫功能嚴重受損，增加了對危及生命的感染、自身免疫和惡性腫瘤的易感性，具有極高的病死率［25］。盡管同種異體造血干細胞移植可治愈PID，但受供體來源、患兒健康狀態和致病基因種類等因素的影響，大多數患者無法接受該治療。并且移植后患者也會面臨患移植物抗宿主病及移植物排斥的風險。基因治療將正常基因導入自體造血干細胞后再進行移植，一定程度上解決了傳統造血干細胞移植面臨的問題。但是半隨機整合載體都存在插入性致癌風險。盡管改進病毒載體能降低該風險，但仍不能實現基因表達的生理性調控。而基因編輯原位糾正基因，使基因表達受內源性調控。目前，基因編輯技術在PID的治療應用中常與自體造血干細胞移植相結合，提供了一種治愈可能的理想方案。

2.1 X-連鎖重癥聯合免疫缺陷病

X-連鎖重癥聯合免疫缺陷病（X-linked severe combined immunodeficiency disease，X-SCID）是SCID最常見的類型，由IL-2受體共同γ鏈（IL-2 receptor common gamma chain，IL2RG）缺陷導致細胞內信號轉導障礙，造成T、B、NK細胞數量及功能缺陷。既往研究表明，IL2RG表達正常的淋巴祖細胞比缺陷祖細胞更具選擇性生長優勢，因此只需少量校正的造血干祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）即可重建T細胞免疫［26］。2014年，Genovese等［27］首次運用ZFN將包含IL2RG基因外顯子5～8互補DNA（complementary DNA，cDNA）導入X-SCID患者HSPC的致病基因中，后代細胞顯示出正常的IL2RG表達。為突破HSPC的培養及擴展限制，2015年研究者使用XSCID患者來源的誘導多能干細胞進行實驗，并利用設計更靈活的TALEN對目標基因座定點修飾，觀察到前體T細胞及成熟NK細胞的產生［28］。為評估校正后的HSPC免疫重建的有效性和安全性，研究者使用ZFN將完整IL2RG的cDNA整合到原基因座的內含子1處，并將所編輯的HSPC移植入實驗小鼠中，在第16周顯示出同源定向修復校正的細胞平均為12%，超過免疫重建所需功能性HSPC的閾值［29］。而最近的一項研究中改用特異性更高的CRISPR-Cas9實現了高效整合，并無異常造血和脫靶突變的跡象，這為97%以上的X-SCID患者建立有長期治療及潛在治愈策略的臨床開發提供強有力的支持［30］。

2.2 慢性肉芽腫性疾病

慢性肉芽腫性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）由負責中性粒細胞呼吸爆發的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶復合物亞基編碼基因缺陷導致，臨床上以反復嚴重感染、炎癥性疾病及肉芽腫形成為特征。研究表明，XCGD患兒臨床獲益所需功能正常的中性粒細胞約為10%～15%，因此基因編輯的治療作用易在CGD中體現［31］。在CGD致病基因中，CYBB基因占比65%，而NCF1基因占比25%，因此該病的治療主要集中于這兩類型［32］。2011年，Zou等［33］的研究中首次使用ZFN介導密碼子優化的CYBB基因靶向插入X-CGD患者誘導多能干細胞的安全港基因座中，觀察到CGD表型的完全功能校正。然而，誘導多能干細胞只能產生少量的造血干細胞，因此2017年研究者采用CRISPR/Cas9系統對X-CGD患者的CD34+HSPC進行校正，測序確認超過20%HSPC的基因修復，植入小鼠體內可產生功能正常的人骨髓/淋巴樣細胞，并無插入缺失突變產生［31］。NCF1基因最常見的突變是外顯子2核苷酸GT缺失（ΔGT），而該基因附近高度保守的假基因NCF1和NCF2也有該突變。2017年，有研究使用ZFN對CGD患者的誘導多能干細胞中NCF1基因外顯子2ΔGT進行校正，顯示在NCF1基因座或其假基因上的基因校正，引起與氧化酶活性恢復相關的p47蛋白的表達［34］。這是由基因編輯介導假基因修復的單基因疾病功能校正的首次報道。但由于3個編輯位點存在可導致更大的缺失、倒位和易位，從而潛在地導致染色體不穩定［35］。因此在隨后Khan等［36］的研究中，選用與假基因有3個額外堿基對差別的NCF1內含子1作為靶點通過CRIS‐PR/Cas9介導小基因插入，觀察到p47phox的表達幾乎恢復到野生型水平。

2.3 其他原發性免疫缺陷病

X連鎖高IgM綜合征指活化T細胞表面CD40配體基因突變引起免疫球蛋白類別轉換重組障礙的單基因疾病。2016年，Hubbard等［37］首次使用TALEN介導致病基因修復，實現了患者T細胞CD40配體的正常表達和IgG類別轉換的修復。而Kuo等［38］的研究更注重于HSPC的基因編輯，將使用TALEN或CRISPR-Cas9校正的HSPC移植入免疫缺陷小鼠中能達到臨床相關水平的編輯率，這為永久性治療該疾病提供了基礎。Wiskott-Aldrich綜合征（Wiskott-Aldrich syndrome，WAS）由WAS基因突變使WAS蛋白缺乏導致，臨床以血小板減少伴血小板體積減小、濕疹、免疫缺陷、易患自身免疫性疾病和惡性腫瘤為特征。在Laskowski等［39］的研究中，首次利用ZFN將功能性基因導入誘導多功能干細胞的相應基因座中，觀察到正常WAS蛋白的表達。而最新的研究則利用CRISPR-Cas9技術向WAS病人HSPC中遞送編輯試劑，校正細胞多達60%，并且無細胞活力和分化潛能損害［40］。

3 挑戰與展望

目前CRISPR/Cas系統及其衍生系統堿基編輯和先導編輯為各領域的研究熱點。然而，在最近發現，人類血液中存在針對Cas9蛋白的抗體和T細胞［41］。雖然目前對已存在T細胞的殺傷能力尚不清楚，但使用具有Cas9蛋白組件的基因編輯工具治療人類疾病時，其安全性需要著重考慮。針對這一問題，研究者們提出一些思路來解決，比如：使機體免疫抑制或缺失來防止細胞對Cas9的嚴重反應，或者使用不感染人體或正常寄生菌的Cas9蛋白，又或者在人類對Cas9產生適應性免疫反應之前使用基于Cas9的療法，但這些方法的有效性有待驗證。

對于PID的基因編輯，大多數研究仍處于臨床前研究階段，臨床應用面臨的最大挑戰是從體外到體內同源定向修復率的不斷變低。這可能是由于同源定向修復更易發生在S/G2期，因此分化程度越高的短期干細胞越易發生定向編輯，而更原始的長期干細胞則進行非同源末端連接。并且原始造血干細胞可能對雙鏈斷裂更敏感，在編輯過程中易于受損。這導致有長期再生能力的干細胞未進行真正的基因校正，或是校正后由于受損失去了移植和自我更新的能力。雖然有一些研究表明，使用一些小分子暫時控制DNA修復［42］和操縱DNA修復蛋白［43］，能維持和擴增真正的造血干細胞數量，但也只是增加了基因校正造血干細胞的數量。迄今為止，如何編輯真正長期移植、具有自我更新能力的干細胞仍是一大問題。

目前，DNA修復機制、干細胞生物學和基因組編輯技術方面的研究快速進展，基因編輯PID應用有極大希望發展到臨床階段。此外，它有望治愈無法通過增加基因拷貝策略治療的疾病，也可以治愈因同種異體骨髓移植而病重的患者。盡管該領域仍然存在未解決的問題和許多挑戰，但是基因編輯在PID根治中具有巨大的潛力毋庸置疑。