外泌體：肝纖維化中藥調控新靶標*

楊悅，唐露露，魏濤華，，郝文杰，錢南南，楊文明，3

1 安徽中醫藥大學研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

3 新安醫學教育部重點實驗室 安徽合肥 230038

肝纖維化是在各種致病因素作用下導致的以細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）過度沉積為病理特征的一種慢性肝病，其發病機制與多種細胞因子以及多種信號傳導途徑有關，早期若不能得到很好的控制，病情遷延不愈日久可發展為肝硬化甚至肝癌。流行病學顯示，肝纖維化的發病率逐年增加，已經成為全球重要的公共衛生負擔。迄今為止，尚無特效療法可用于肝纖維化的治療。因此，深入肝纖維化機制研究和加速抗肝纖維化藥物研發顯得尤為重要。外泌體作為近年來的研究熱點，越來越多研究證實外泌體參與肝纖維化形成的病理生理過程，可能是調控肝纖維化進程的重要靶標。

外泌體（Exosome）是一類特殊的細胞外囊泡，直徑在 30～100nm，可攜帶核酸、蛋白質、脂質、細胞因子和其他生物活性物質，是細胞間傳遞的重要物質。大部分哺乳動物細胞都會產生外泌體，并且不同細胞分泌的外泌體的組成或數量會有所不同，具有高度特異性。在人體內，外泌體可廣泛存在于唾液、血清、血漿和尿液等體液中。1983 年，Johnstone 等人首先在綿羊網織紅細胞的培養過程中發現外泌體[1]。起初，外泌體具有脫落膜蛋白作用，用于處理廢棄蛋白質和其他分子[2]。直到1996 年，Raposo 等人報告外泌體參與抗原呈遞和適應性免疫反應[3]，促使外泌體重新受到研究者們的關注和重視。

研究發現，外泌體的發生與多囊泡內體途徑密不可分，外泌體的發生包括早期內體形成、晚期內體形成和多囊泡形成。多囊泡可轉運到溶酶體中進行溶酶體胞吐作用，或與內體膜融合，然后將脂質體釋放到細胞外空間，蛻變成外泌體[4]。報道顯示，外泌體可調節多種病理生理反應，例如炎癥反應、免疫應答、免疫逃逸等。外泌體可以包含有價值的生物標志物，對疾病臨床的治療具有強大的潛力。隨著對外泌體的研究不斷深入，現在已經有大量文獻研究證實外泌體與肝纖維化的關系密切。本文以肝纖維化為研究目標，以外泌體為導向，對外泌體調控肝纖維化相關進展作一綜述，為中藥靶向調控外泌體治療肝纖維化提供理論基礎。

外泌體對肝纖維化發生的調控作用

肝纖維化形成是肝臟對反復損傷后傷口愈合反應的過程，該過程與炎癥反應后ECM 的沉積有關。ECM 形成是一個復雜的過程，涉及包括免疫細胞在內的肝實質細胞和非實質細胞，它們起著雙刃劍的作用，不僅可以促進肝纖維化的發展，也能有助于肝纖維化的消退。肝纖維化即是機體對肝損傷后的修復反應，是多種細胞因子參與、多種信號介導的動態過程，是各種慢性肝病的共有病理改變。

慢性損傷后，肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活，轉化為成肌纖維細胞樣細胞，活化的HSCs 在組織修復部位遷移并積聚，產生大量ECM 并調節ECM 降解。簡而言之，HSCs 的活化是肝纖維化形成的關鍵環節，增殖的HSCs 通過分泌膠原蛋白而促進ECM 的積累，導致肝纖維化的發生。而外泌體可以通過靶向傳遞活性物質到HSCs，并參與HSCs 的活化、增殖、遷移及凋亡過程，進而調控肝纖維化的進程。

1 肝實質來源外泌體

實質細胞，也稱為肝細胞，約占肝臟總體積的80%，具有排泄膽汁、合成糖原、解毒等作用。肝細胞可以釋放外泌體，并且釋放的外泌體在肝細胞與肝細胞的通訊以及肝細胞與HSC 的通訊中均具有重要作用。研究發現，外泌體通過整聯蛋白配體纖連蛋白整合素粘附和觸發鞘氨醇激酶1（Sphingosine kinase1，SK1）反應，調節HSCs 信號傳導和遷移[5]。肝細胞分泌的外泌體直接與靶細胞融合，并轉移中性神經酰胺酶和鞘氨醇激酶2（Sphingosine kinase2，SK2），導致靶細胞內鞘氨醇-1-磷酸酯（Sphingosine-1-phosphate，S1P）的合成增加，促進肝臟修復和再生[6]。

Devhave[7]等人研究發現與健康志愿者和非丙型病毒性肝炎（Hepatitis C virus，HCV）相關肝纖維化患者相比，在HCV 感染的肝細胞和慢性肝炎纖維化患者血清中外泌體中miRNA-19a 均呈高表達。進一步結果表明，來自HCV 感染的肝細胞的攜帶外泌體miRNA-19a，并通過調節SOCS-STAT3 軸來激活HSCs，阻止肝纖維化。在砷誘導的肝纖維化模型中發現肝臟中存在MALAT1 的過度表達，肝細胞的外泌體MALAT1 通過miRNA-26b 調節COL1A2 誘導HSCs活化，參與纖維化產生[8]。Lee[9]等人發現棕櫚酸處理過的肝細胞衍生的外泌體可誘導HSCs 活化，提示外泌體可能在通過調節肝細胞與HSCs 之間的通訊影響肝纖維化進程。Zhang[10]等人研究發現與非纖維化組織相比，人肝纖維化組織表達的TRIB3 和選擇性自噬受體SQSTM1/p62（螯合體1）水平更高，并且在纖維化組織中TRIB3 和SQSTM1 的表達升高呈正相關。TRIB3 介導的自噬損傷不僅抑制晚期內體的自噬降解，而且促進肝細胞分泌富含INHBA/Activin A 的外泌體，從而引起肝纖維化的效應細胞（即HSCs）的遷移，增殖和活化。

2 肝非實質細胞來源的外泌體

非實質細胞包括HSCs，肝竇形內皮細胞，肝巨噬細胞以及膽管細胞，雖然非實質細胞總數只占肝臟細胞總數一小部分，但是它們在肝臟生理病理過程中發揮著不容忽視的作用。這些非實質細胞釋放各種物質來通過分泌外泌體調節或輔助肝細胞或鄰近的非實質細胞的功能，促進肝損傷后的肝臟重塑。

在肝纖維化過程中存在結締組織生長因子2（Connective tissue growth factor，CCN2）過表達，CCN2 促進HSCs 的許多分化功能，包括有絲分裂、趨化性、粘附、活化和成熟。HSCs 衍生的外泌體CCN2通過Twist1/miRNA-214/CCN2 纖維化信號軸間穿梭于細胞間，向細胞外轉運和遞送至靶細胞。HSC 負責miRNA-214 的細胞間穿梭，而miRNA-214 是HSCs中CCN2 依賴性纖維發生的調節劑。miRNA-214 通過外泌體從HSCs 供體細胞向相鄰的受體HSCs 或肝細胞進行細胞間轉運，隨后對CCN2 3’-UTR 進行調節。外泌體miRNA-214 通過靶向遞送至活化的HSCs，降低內源性CCN2 表達，抑制α-SMA 的表達，改善肝纖維化程度[11-12]。

HSCs 中外泌體可以通過介導的TLR3 激活IL-17A，IL-1β 和IL-23 的產生，觸發γδT 細胞產生強大的IL-17A。此外，外泌體介導的TLR3 激活增加HSC 中CCL20 的表達，從而導致CCR6 +γδT 細胞的募集，加劇肝纖維化進程[13]。研究表明，HSCs 中的miRNA-199a-5p 可以通過靶向抑制CCN2 3'-UTR 活性，降低纖維生成基因表達[14]。另有研究表明，在肝纖維化小鼠中以及體外TGF-β1 誘導的活化的HSCs外泌體中miRNA-30a 存在顯著下調，miRNA-30a 通過直接靶向其3'-UTR 區，抑制Beclin1 介導的自噬，阻止細胞外基質過度積累，減輕了纖維化程度[15]。

HSC 是肝纖維化的主要效應細胞，已發現多種lncRNA 在HSC 的激活中起重要的調控作用。原發性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）屬于自身免疫性肝病中的一種，研究發現，來自PBC 的異常外泌體在抗原呈遞細胞的不同亞群中選擇性誘導共刺激分子的表達[16]。lncRNA-H19 是父系印跡的母體表達的lncRNA，在胚胎發育過程中高度表達，但出生后迅速下調。最近，越來越多的研究表明，H19 廣泛參與了各種器官纖維化的病理機制。研究發現，在PBC 患者及小鼠模型中，H19 水平與肝纖維化的嚴重程度密切相關[17]。H19 由膽管細胞衍生，可通過促進HSC 分化和激活在膽汁淤積性肝纖維化的進展中起關鍵作用，可通過抑制肝細胞中小的異二聚體伴侶表達來破壞膽汁酸穩態，從而促進Mdr2-/-小鼠膽汁淤積性肝損傷[18]。進一步研究結果表明，發現膽汁淤積性肝病患者肝臟中S1PR2 和SphK2 的表達上調，且熒光素酶實驗證實H19 充當miRNA let-7 的分子海綿，而HMGA2 是let-7 的靶標。簡而言之，H19 通過調節S1PR2/SphK2 和let-7/HMGA2 信號軸在膽汁淤積性肝纖維化起關鍵作用[19]。

另外，有研究表明源自脂多糖處理的THP-1 巨噬細胞的外泌體miRNA-103-3p 可以通過靶向Krüppel 樣因子4 促進HSC 增殖并誘導纖維化基因表達增加，促進肝纖維化進程[20]。

3 其他細胞來源外泌體

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多能干細胞，具備強大的增殖、免疫調節和自我復制能力，并認為有歸巢特質，是一種理想的細胞療法。人臍帶間充質干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC）可以顯著恢復AST活性，降低I 型和III 型膠原產生以及TGF-β1 和磷酸化Smad2 表達，通過抑制細胞外基質的產生，保護肝細胞，改善肝纖維化[21]。研究發現，MFGE8 是MSCs 分泌的一種抗纖維化蛋白，可強烈抑制TGFβ信號傳導并減少細胞外基質沉積和肝纖維化[22]。源自絨毛膜源性間充質干細胞（Chorionic mesenchymal stem cells，CP-MSCs）的miRNA-125b 抑制Hedgehog信號通路的激活，從而抑制肝纖維化的發生。另外，有研究表明來源于人骨髓間充質干細胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hbmMSCs）的外泌體可以下調Wnt 信號通路中PPARγ、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin 的表達，從而有助于抑制下游基因WISP1、Cyclin D1 的表達，抑制HSCs 活化，從而降低肝纖維化水平[23]。脂肪間充質干細胞來源（Source of Adipose Mesenchymal Stem Cells，AMSC）的外泌體經miRNA-122 的修飾后介導AMSC 與HSCs 之間的通訊，進一步影響miRNA-122 靶基因的表達水平，例如胰島素樣生長因子受體1，細胞周期蛋白G 和脯氨酰4-羥化酶a1，參與HSCs 的增殖和膠原蛋白的成熟[24]。

內皮細胞衍生來源的外泌體富含SK1，SK1 通過與纖連蛋白及整合素結合粘附在HSCs 膜上，并依賴于dynamin-2 途徑介導外泌體進入HSCs 內，調節病理性HSC 遷移[25]。而源自自然殺傷細胞的外泌體可顯著抑制TGF-β1 誘導的HSCs 增殖和活化，減輕經CCl4誘導后小鼠的肝纖維化程度[26]。

外泌體在肝纖維化治療中的作用

目前肝纖維化缺乏特異性治療，新型抗肝纖維化策略的研發成為臨床研究的熱點。外泌體作為細胞通訊間的重要物質，不僅可以作為潛在生物標志物用于診斷和預后，也可以作為各種疾病的治療靶標。越來越多的研究揭示了外泌體在肝臟疾病中的作用，在肝纖維化過程中，外泌體可以通過介導細胞之間的通訊發揮作用，提示外泌體可能是臨床潛在的治療靶標。

MSCs 分泌的外泌體是一種新型的無細胞療法，已經在多種肝病動物模型中報道了MSCs 衍生的外來體的治療功效，說明可能是治療肝纖維化的一種新策略[27]。hucMSC 來源的外泌體具有抗氧化和抗凋亡的能力，可以抑制CCl4 誘導的肝纖維化模型小鼠肝組織中8-OhdG、MDA 以及caspase 3 蛋白以及TGF-β 表達[28]。脂肪來源的間充質干細胞分泌的外泌體可以將miR-181-5p 直接靶向Bcl-2 和STAT3 的30-UTR上的潛在結合位點防止結合，選擇性轉移至受損的肝細胞，激活Beclin-1 啟動自噬反應，從而減輕肝臟損傷[29]。miRNA-122 是肝臟中最豐富的miRNA，可調節飲食誘導的肝細胞缺氧誘導因子-1 和波形蛋白的表達，可能在脂肪性肝纖維化中發揮作用[30]。通過慢病毒介導的pre-miRNA-122 轉移構建miRNA -122修飾的AMSC-122，AMSC-122 表達高水平的miRNA-122，并且可仍保留其表型和分化潛能，可以更有效地抑制HSCs 的增殖和膠原蛋白的成熟。結果表明，采用miRNA-122 修飾是治療肝纖維化的新潛在策略[24]。采用TNF-a 預處理急性肝衰竭中臍帶間充質干細胞衍生的外泌體可通過上調miRNA-299-3p，抑制NLRP3 途徑的激活來減輕急性肝衰竭引起的炎癥損傷并促進肝組織修復[31]。另外有研究表明，正常健康個體的外泌體miRNA-34c、miRNA-151-3p，miRNA-483-5p、miRNA-532-5p 和miRNA-687 具有抗纖維化作用[32]。

根據肝纖維化病理特征和臨床表現，中醫將其歸集在“積聚”“黃疸”“脅痛”“腹痛”等病證范疇。其基本病機為“虛損生積”，其中“積”指的是血瘀，其主要表現為纖維結締組織的過度沉積，并認為“血瘀為肝硬化之體”，活血化瘀是治療肝纖維化的基本原則[33]。大量的研究表明，中醫藥在防治肝纖維化上具有獨特優勢。研究顯示姜黃具有良好的行氣活血功效，臨證使用廣泛。姜黃素是姜黃的的主要活性成分，具有抗炎、抗癌以及免疫調節等作用，大量研究證實姜黃素可通過調節肝組織中多種通路信號轉導，促進肝臟修復、緩解肝臟損傷[34，35]。在體內膽管結扎誘導的纖維化模型大鼠中，姜黃素可通過下調miRNA-21，上調miRNA-122，從而抑制TGFβ1表達，阻止肝纖維化進程[36]。在體外HepG2 和HCCLM3 細胞模型中，也證實姜黃素治療可下調miRNA-21 表達，上調TIMP3表達并抑制TGF-β1/smad3 信號通路，發揮保護肝臟作用[37]。血瘀既是肝纖維化的病理產物，也是導致肝纖維化的致病因素。因此，活血化瘀法應貫穿本病治療的始末。《婦人明理論》云：“一味丹參散，功同四物湯”。丹參味苦性微寒，功善活血祛瘀，破癥除瘕。而“虛”主要表現在氣血、陰精等方面，反映了人體臟腑功能的損傷與降低。黃芪作為補氣藥物之首，其性微溫味甘，功善益氣健脾。黃芪聯用丹參是臨床治療肝纖維化的主要藥對之一，現代研究顯示，黃芪、丹參以及其有效成分具有良好的抗肝纖維化作用。在體內二乙基亞硝胺大鼠中誘導的肝癌（Hepatic carcinoma，HCC）動物模型和體外TGF-β1刺激的HepG2 細胞模型，復方黃芪和丹參提取物通過介導miRNA-145/miRNA-21 和Smad3 磷酸化的相互作用，抑制HCC進程[38]。青蒿素是從中藥青蒿中提取的一種化合物，其具有良好的抗瘧性。近年來，青蒿素類衍生物對免疫性肝損傷的保護作用逐漸成為關注的熱點，雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）可以減少小鼠肝組織中的TGF-β1和TNF-α 的含量來發揮抗肝纖維化作用[39]。DHA 可以通過抑制了 lncRNA-H19 的表達水平，調控HSCs 脂滴代謝發揮抗肝纖維化作用[40]。最新研究表明，lncRNA-H19、Meg3、以及Snhg18 也是肝豆狀核變性又名Wilson 病（Wilson’s disease，WD）的TX 小鼠肝臟組織中差異表達的關鍵lncRNA[41]。而肝纖維化幾乎是每一個WD 患者主要肝臟病理改變，是進展至肝硬化的必經階段。早期干預肝纖維化的進展變得尤為重要，阻斷和延緩肝纖維化的發展是治療WD 的重要策略。楊文明總結得出WD肝纖維化“肝腎虧虛、痰瘀互結”的病機理論，并針對這一病機創制了中藥復方肝豆扶木湯。肝豆扶木湯作為WD 肝纖維化的臨床效方[42]，前期結果表明，其對TX 小鼠肝纖維化具有逆轉作用[43]。因此，我們推測上述基因可能是肝豆扶木湯作用的關鍵靶點。

結 語

目前肝纖維化治療的基本策略主要是采用去除病因聯合抗肝纖維化治療，由于肝纖維化病理機制復雜，西藥靶點作用單一，臨床療效有限，新型抗肝纖維化藥物的研發成為我們亟待解決的問題。外泌體由雙層脂質囊泡構成，可由多種細胞釋放，并且可以攜帶多種物質，具有良好的靶向性和穩定性，能夠通過特定的信號通路介導與靶細胞結合。因此，采用外泌體進行治療是一種有前景的調節肝纖維化相關途徑的手段。外泌體作為細胞通訊間的重要物質，是近年來醫學界研究的熱點。越來越多研究證明，外泌體在慢性肝病生理病理過程中發揮重要作用，可能是中藥調控肝纖維化的重要靶標。