牛妊娠相關(guān)糖蛋白16（bPAG16）基因密碼子優(yōu)化及表達

劉長彬，盧春霞，盧守亮，倪建宏

（1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；2. 長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100）

0 引言

【研究的意義】在規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中，奶牛產(chǎn)犢間隔長、繁殖效率低是影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的主要問題，而對配種后奶牛準確及時地進行早期妊娠診斷，是縮短空懷時間、產(chǎn)犢間隔和提高奶牛繁殖效率重要手段之一。目前，采用免疫分析技術(shù)檢測血液或奶樣中牛妊娠相關(guān)糖蛋白（Pregnancy-associated glycoproteins, bPAG）已成為國際上應(yīng)用最廣泛的奶牛早期妊娠檢測方法[1?2]，商品化PAG-ELISA 檢測試劑盒可對人工授精后28 d 的奶牛進行早期妊娠診斷，并獲得較高的準確率[3?4]。但PAG 檢測試劑盒主要依賴國外進口，高昂的檢測成本（約40 元每頭次）限制了其在國內(nèi)的大規(guī)模推廣應(yīng)用。高純度bPAG蛋白的獲得對研發(fā)簡便、經(jīng)濟、快速的bPAG 檢測技術(shù)至關(guān)重要。【前人研究進展】牛妊娠相關(guān)糖蛋白（bPAG）屬于天冬氨酸蛋白酶家族，是由胎盤滋養(yǎng)層細胞合成、分泌的一類糖蛋白。bPAG 基因家族至少有22 個轉(zhuǎn)錄本[5]，根據(jù)其產(chǎn)生的時間，可分為“古代組”和“現(xiàn)代組”。“古代組”bPAG（bPAG2、8、10-13）由滋養(yǎng)外胚層細胞合成，具有酶活性[5?6]；而“現(xiàn)代組” bPAG（bPAG1、3-9、14-22）僅在胎盤滋養(yǎng)外胚層雙核細胞中表達，在進化過程中由于堿基發(fā)生了突變而失去酶活性。bPAG 對維持妊娠發(fā)揮一定作用，在胚胎附植后不久即遷移到母體外周血中[5?7]，因 而常作為妊娠檢測的一種生物標記物[2,8]。目前，PAGs 蛋白主要采用溶液提取、硫酸銨沉淀和色譜分離等技術(shù)從母畜胎盤子葉中分離純化而獲得[9?10]，但是PAGs 蛋白種類較多，同源性較高，傳統(tǒng)的分離純化方法很難獲得單一形式的高純度PAG蛋白，且工藝復(fù)雜。隨后研究者利用PAGs 可特異性結(jié)合豌豆凝集素[11]、胃蛋白酶抑制劑[12]的特性來分離純化PAGs，但高的分離成本不利于PAGs 的大量純化。重組蛋白技術(shù)為PAGs 的功能研究及應(yīng)用提供了新思路，2004 年P(guān)atel 等[13]在HEK 293 和CHO細胞中表達了bPAG1 重組蛋白。目前，國內(nèi)關(guān)于bPAG的研究報道極少。薄小輝[14]將bPAG4 基因插入到pET28a 表達載體，通過原核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)表達了bPAG4 重組蛋白。【本研究切入點】本團隊成功構(gòu)建了PCDNA3.1（?）-bPAG1、proEM-bPAG4、proEMbPAG9 等多種重組表達載體，通過真核表達系統(tǒng)制備了bPAG1、bPAG4、bPAG9 重組蛋 白[15?17]。但迄今為止，尚未見到關(guān)于bPAG16 重組蛋白的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用密碼子優(yōu)化策略對bPAG16 基因進行了設(shè)計和優(yōu)化，然后通過真核表達系統(tǒng)制備bPAG16 重組蛋白，解決傳統(tǒng)的PAG 蛋白分離純化方法成本高、效率低的問題，為bPAG 抗體的制備和開發(fā)相應(yīng)的早孕檢測產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ProEM 載體、HEK293、DH5a 菌株來自德泰生物科技（南京）有限公司；Pfu DNA 聚合酶、EcoRI、HindIII 內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、dNTP、DNA mark、蛋白Mark、4S Red Plus、小鼠抗6× His 單克隆抗體、瓊脂糖、Ni-IDA 蛋白純化試劑盒、SDS-PAGR變性丙烯酰胺凝膠試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Axygen DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司；Gibco?FreeStyle? 293 表達培養(yǎng)基、Opti-MEM、Gibco?Anti-Clumping-Agent、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒等購自Thermo Fisher 公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti? 96 梯 度PCR 儀（美 國ABI）；Essential V4 凝膠成像系統(tǒng)（英國UVITEC）；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD）；Powerpac 300 電泳儀（美國BIO-RAD）；Thermo311 CO2培養(yǎng)箱（美國熱電公司）；?KTA Explorer 100 蛋白純化層析系統(tǒng)（美國GE 公司）；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國賽默飛）。

依據(jù)待檢樣品標簽聲稱的乳酸菌類別和含量，估算待檢樣品中是否含有嗜熱鏈球菌及其數(shù)量，選擇（2～3）個合適的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平行。同時分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。然后注入約15 mL冷卻至（48±1）℃的MC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使之混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)（72±2）h，培養(yǎng)后計數(shù)與計算。

1.3 試驗方法

1.3.1bPAG16 基因優(yōu)化與合成 根據(jù)GenBank 公布的bPAG16（登錄號：NM_176625.1）基因序列，通過在線軟件Graphical Codon Usage Analyser 計算bPAG16 基因的同義密碼子使用度，分析其密碼子使用偏好性。然后利用優(yōu)化軟件MaxCodonTM優(yōu)化bPAG16，在不改變氨基酸序列的原則下，將HEK 宿主細胞偏好密碼子替換目標基因中非偏好密碼子，提高密碼子適用指數(shù)（CAI），改變G+C 含量，同時在優(yōu)化基因的兩端設(shè)計EcoRI、HindIII 酶切位點和His 標簽，并在EcoRI 酶切位點之后添加保護堿基序列。然后應(yīng)用 Primer Premier 軟件設(shè)計18 條引物，首尾引物如下：bPAG16 引物1：5′-AGT TTA AAC GGA TCT CTA GCG AAT TCC CGC CGC CAC CAT GAA GTG GCT GGT GCT CCT GGG ACT GGT GGC TTT CAG CGA GTG CAT CG-3′（下劃線為EcoRI 酶切位點），bPAG16 引物18：5′-TTG CCG GCC TCG AGC GGC CGC TAG CAA GCT TAT CAG TGG TGG TGA TGA TGA TGC ACG GCT CTT GCC AGG CCG ATT CTG TCG TTG C-3′（下劃線為HindIII酶切位點），其余引物未列出。優(yōu)化的bPAG16 基因由德泰生物科技（南京）有限公司通過全基因合成法合成。

對照品：磷酸肌酸鈉（批號100875‐201302）、肌酸（批號100876‐200901）、三磷酸腺苷二鈉（批號140674‐200401）、二磷酸腺苷二鈉（批號 140809‐201501）、一磷酸腺苷鈉（批號 14719‐200501）、肌酐（批號100877‐200901）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3.3 ProEM-bPAG16 重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5a 受態(tài)細胞，搖菌培養(yǎng)30 min。取20 μL 菌涂到含有氨芐青霉素（100 μg·mL）的LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落進行PCR 鑒定，陽性克隆接種到LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h 后提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同1.3.2。將鑒定得到的陽性克隆送上海生工生物公司測序，測序結(jié)果進行BLAST 比對分析。

一是走進重點整治地區(qū)，到群眾反響強烈的區(qū)域宣傳。聚焦涉惡問題突出、群眾反映強烈的重點地區(qū)、行業(yè)領(lǐng)域開展宣傳。針對菜園壩地區(qū)社情民情復(fù)雜，治安形勢嚴峻的特點，區(qū)委政法委組織掃黑除惡專項領(lǐng)導(dǎo)小組成員單位分管領(lǐng)導(dǎo)、黨員代表、政法干警代表、交通、運輸、文化、旅游、城管、房管、衛(wèi)生等行業(yè)代表和居民群眾代表在菜園壩北廣場開展集中宣傳活動。公安干警、社區(qū)居民群眾現(xiàn)場以群眾喜聞樂見的形式表演了自編自導(dǎo)的舞蹈《沖上云霄》、方言快板《全民參與掃黑除惡》等文藝節(jié)目。不同行業(yè)的從業(yè)人員代表走上舞臺集中宣誓，表達掃黑除惡專項斗爭戰(zhàn)之必勝的信心和決心。

1.3.2 ProEM-bPAG16 重組載體的構(gòu)建 參照課題組前期報道的酶切方法[17]，將表達載體ProEM 用EcoRI和HindIII 在37 ℃水浴中酶切1 h。酶切體系為：EcoRI 2.5 μL（10 U·μL?1），HindIII 2.5 μL（10 U·μL?1），ProEM 載體5 μL，10× FD Buffer 5 μL，ddH2O 加至50 μL。將酶切產(chǎn)物與目的基因在22 ℃下連接2 h，連接體系：4 μL 目的DNA 片段，3.5 μL 線性proEM載體，1 μL T4 DNA 連接酶（5 U·μL?1），2 μL 10×T4 buffer，9.5 μL ddH2O。

重組蛋白經(jīng)Ni-IDA 柱分離，咪唑溶液洗脫，各組分經(jīng)SDS-PAGE 進行檢測，結(jié)果如圖6 所示，在500 mmol·L?1的咪唑洗脫溶液中獲得分子質(zhì)量約為48 kDa 的目的蛋白，純化后的蛋白條帶單一。經(jīng)Gel-Pro Analyzer 灰度分析，重組蛋白bPAG16 純 度大于90%。BCA 法測定其含量為0.1 mg·mL?1。

在SDS-PAGE 檢測基礎(chǔ)上進行Western blotting分析，分析結(jié)果如圖7 所示，在約48 kDa 處出現(xiàn)特異性雜交條帶，進一步證明了bPAG16 重組蛋白成功表達。

2.1 bPAG16 基因優(yōu)化與合成

運用condnW 軟件分析了bPAG16 基因密碼子偏好性（表1），采用同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage, RSCU）反 映密碼子使用的偏好性，當某密碼子的RSCU值＞1 時，則表明該密碼子使用頻率較高。從表1 可看出除去終止密碼子，bPAG16 基因中有25 個密碼子的RSCU＞1，其中 CTG、AGA、TCT、GCC 密碼子 RSCU≥2，偏好性較強。為了使表達基因的同義密碼子使用頻率盡可能與宿主細胞相匹配，以提高其基因表達水平，本試驗對bPAG16 基因進行了優(yōu)化，將使用頻率低的密碼子進行替換，優(yōu)化后的密碼子基本為宿主細胞偏好密碼子。優(yōu)化前后的堿基序列和氨基酸序列見圖1，優(yōu)化后的序列全長為1 185 bp，蛋白編碼區(qū)（CDS）長度為1 140 bp，編碼 380 個氨基酸（AA）；優(yōu)化前后核苷酸同源性為76.4%，氨基酸同源性100%。優(yōu)化后bPAG16基因的密碼子適用指數(shù)（CAI）由0.77 提高到0.96（圖2），GC 含量由48%提高到58%（圖3）。將優(yōu)化后的bPAG16 基因進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因片段大小與理論值相符（圖4）。

2.2 重組質(zhì)粒ProEM-bPAG16 的鑒定

陽性克隆PCR 鑒定結(jié)果見圖5-A，目的條帶與預(yù)期值大小相同。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果見圖5-B，泳道1 為未酶切的重組質(zhì)粒，從上至下分別為重組質(zhì)粒的環(huán)狀、線性和超螺旋3 種狀態(tài)，泳道2 為EcoRI 和HindIII 雙酶切后的重組質(zhì)粒，上端片段為ProEM 載體，片段長度為4 369 bp，下端片段為優(yōu)化的bPAG16 基因，片段大小為1 179 bp，與理論值一致，表明重組載體構(gòu)建成功。陽性克隆的測序結(jié)果與優(yōu)化基因bPAG16 的堿基序列完全一致，其編碼的氨基酸與GenBank 公布的完全一致（protein ID：NP_788790.1）。結(jié)果表明優(yōu)化的基因序列正確插入表達載體中，未發(fā)生堿基突變。

表 1 bPAG16 基因密碼子偏好性分析Table 1 Codon usage of bPAG16 gene in Ampullaria crossean

2.3 重組蛋白的表達及純化

1.3.4 重組bPAG16 蛋白的表達及純化 參照本團隊前期報道的方法[16,17]，將HEK293 細胞在37 ℃下進行復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移至10 mL 培養(yǎng)基中，800 r·min?1離心5 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸HEK293 細胞，使其密度為3～4×105cells·mL?1。然后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中，在110 r·min?1、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當接種密度達到1×106cells·mL?1，加入轉(zhuǎn)染級重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，在110 r·min?1、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5～6 d。收集細胞培養(yǎng)物，12 500 r·min?1離心10 min，上清過0.22 μm 濾膜，然后于10 mmol·L?1PBS 中4 ℃下透析過夜。透析液純化前，Ni-IDA 柱用10 mmol·L?1PBS 平衡，流速為1 mL·min?1，直至流出液在280 nm 處的紫外吸光值達到基線水平。透析液以同樣的流速上柱，然后用10 mmol·L?1PBS 沖洗Ni-IDA 柱，最后用洗脫液（10 mmol·L?1PBS，包含50 mmol·L?1或500 mmol·L?1咪唑）進行梯度洗脫，流速為2 mL·min?1。上清液、流出液和洗脫液進行SDS-PAGE 電泳，然后考馬斯亮藍染色并觀察。BCA試劑盒測其蛋白濃度。

2.4 重組蛋白Western blot 鑒定

1.3.5 重組蛋白Western blot 鑒定 將電泳分離后的重組蛋白采用半干式電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉和洗滌后，加入抗 His 標簽小鼠單克隆抗體室溫孵育1 h，之后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，孵育60 min。最后以ECL 發(fā)光試劑進行顯影。

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3 討論

bPAG 是家畜早期妊娠診斷的主要標志物，因此獲取高純度bPAG 蛋白是研發(fā)快速診斷產(chǎn)品的關(guān)鍵所在。由于傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)很難獲得高純度的bPAG 天然蛋白，增加了對其結(jié)構(gòu)和功能研究的難度，也限制了家畜早孕快速檢測產(chǎn)品的研發(fā)。基因工程手段為獲得大量高純度的重組蛋白提供了思路。隨著重組蛋白技術(shù)的發(fā)展，密碼子優(yōu)化成為提高外源基因在宿主內(nèi)表達水平的一種有效手段。不同物種對同義密碼子的使用頻率不同，通過對基因的同義密碼子進行優(yōu)化使其與表達宿主的密碼子偏好性相匹配，可提高蛋白的表達水平[18?19]。通常用密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）來衡量基因的表達水平，CAI 值范圍為0～1，越接近1 表示基因的達標水平越高[20]。本研究在不改變氨基酸序列的前提下，通過替代非偏好密碼子及平衡GC 含量等策略優(yōu)化了bPAG16 基因，優(yōu)化后密碼子CAI 大幅提高，同時減少了AT 和GC 富集區(qū)；然后通過全基因合成技術(shù)合成了bPAG16 基因，并將其插入到ProEM 載體中，成功實現(xiàn)了其在HEK293 細胞中的高效表達。進一步證明了基于全基因合成技術(shù)的密碼子優(yōu)化具有良好的時效性和實用性。

圖 1 bPAG16 基因優(yōu)化前后核苷酸、氨基酸對比結(jié)果Fig. 1 Nucleotide alignment of original and optimized bPAG16 genes

圖 2 bPAG16 基因優(yōu)化前后的密碼子適用指數(shù)對比Fig. 2 CAIs of bPAG16 gene before and after codon optimization

圖 3 bPAG16 基因優(yōu)化前后的GC 含量對比Fig. 3 GC contents of bPAG16 gene before and after codon optimization

圖 4 優(yōu)化bPAG16 基因的PCR 擴增產(chǎn)物Fig. 4 Electropherogram of PCR products of codon-optimized bPAG16 gene

圖 5 陽性克隆（A）及重組質(zhì)粒雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig. 5 Identification of cloning products (A) and recombinant plasmid (B)

圖 6 SDS-PAGE 分析重組蛋白bPAG16Fig. 6 SDS-PAGE analysis on rbPAG16

圖 7 重組蛋白bPAG16 的Western blot 鑒定Fig. 7 Western blotting analysis on rbPAG16

優(yōu)化后bPAG16 基因CDS 長度為1 137 bp，編碼379 個氨基酸殘基，信號肽區(qū)域位于第1～15 位氨基酸殘基，蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為41.82 kDa。SDSPAGE 和Western blotting 分析結(jié)果顯示，重組蛋白的分子質(zhì)量約48 kDa，大于理論值，與Patel[11]和劉長彬等[16, 17]報道的結(jié)果相似。這與rbPAG 在表達過程中存在糖基化修飾有關(guān)，有研究表明bPAG 的氨基酸序列存在N-糖基化位點，導(dǎo)致其在翻譯修飾后分子量增加[21]。本研究下一步擬采用制備的重組bPAG16為靶標，篩選特異性識別bPAG 的核酸適配體，代替抗體作為新型識別分子開發(fā)快速、簡便的bPAG檢測新方法，減低檢測成本，使之更好地應(yīng)用于奶牛早期妊娠診斷。

4 結(jié)論

本研究通過采取密碼子優(yōu)化策略，對bPAG16基因進行重新設(shè)計和優(yōu)化，進一步利用真核表達系統(tǒng)，成功獲得高純度的bPAG16 重組蛋白，為牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)提供了技術(shù)支撐。