木薯MePYL12 基因克隆及采后生理性變質過程的表達分析

郭 靖，章玉香，黃芷頤，吳春來，顏 彥，曾 堅,3，胡 偉

（1. 韶關學院英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口571101；3. 韶關市芳香植物工程技術研究中心，廣東 韶關 512005）

0 引言

【研究意義】脫落酸是植物生長過程中重要的調節因子。ABA 參與了植物各階段的生長過程，同時也作為關鍵因子來響應逆境脅迫[1]。ABA 信號可以提高植物在高滲、高鹽以及干旱等不利生長環境中的存活能力。核心組分為PYR/PYL/RCAR（Pyrabactin resistance/Pyrabactin resistance like/Regulatory component of ABA receptor）、蔗糖非酶解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting1-related protein kinase, SnRK2）及2C類蛋白磷酸酶（Protein phosphatase 2C, PP2C）。接收上游信號的受體為PYR/PYL/RCAR；SnRK2 和PP2C則分別是通路的正負調控因子。ABA 受體、SnRK2和PP2C 共同組成了ABA 介導的信號通路[2?4]。【前人研究進展】在PYR/PYL/RCAR 研究過程中，PARK等科學家通過篩選得到的Pyrabactin 突變株克隆得到了13 個PYR1 同源基因[3]。MA 等科學家則發現PYR/PYL/RCAR 能夠和ABA 結合并抑制ABI的活性[4]。對PYL 家族的結構進行分析顯示，PYL家族成員的蛋白結構中都含有一個由7 個β-折疊和2 個α-螺旋組成的螺旋手柄結構[5?6]。到目前為止，PYR/PYL/RCARs 家族基因在擬南芥中有14 個家族成員[3,7]，番茄中有15 個[8]，棉花中有22 個[9]，水稻中則只有13 個[10]。在擬南芥中，AtPYL5 和AtPYL9基因的過表達可以提高植株應對干旱脅迫和感受ABA 的能力[11?12]。水稻的OsPYL9 基因過表達能提高種子在萌發時對ABA 信號的敏感程度[13]；將耐旱棉花品種中的GhPYL9-11A基因在擬南芥中過表達也可以提高種子在萌發時對ABA 信號的敏感程度[9]。將楊樹中的PtPYRL5 和PtPYRL1 基因過表達能提高楊樹清除活性氧的能力[14]。多個玉米PYL基因的過表達可以提高植株適應干旱脅迫和感受ABA 信號的能力[15]。木薯MePYL8 可能在非生物脅迫的信號轉導中發揮作用，而木薯MePYL13 基因則可能參與了木薯塊根的PPD 過 程[16?17]。不同物種的研究結果顯示PYL基因在植物中參與響應了不同的逆境脅迫。木薯是熱帶和亞熱帶范圍內被大量種植的糧食作物，是全世界將近8 億人口的主糧[18]。我國的木薯種植區域主要為華南地區，是該地區一種重要的經濟作物，全國約有50 萬 hm2的種植面積，每年的總產量約為500萬 t，年總產值約為人民幣150 億元[16]。木薯具有耐貧瘠和抗旱等特性，可作為重要的綠色能源[16,19?20]。但木薯塊根由于收獲后出現“采后生理性變質”現象（post-harvest physiological deterioration, PPD），使 其無法長時間保存，因而也限制其在生產中的大規模利用[21?23]。【本研究切入點】ABA 受體PYR/PYL/RCARs 家族基因是ABA 信號通路中重要的組成成分，在ABA 介導的非生物脅迫應答中具有重要作用。因此，研究PYL基因在PPD 過程和非生物脅迫中的功能，能夠為進一步研究ABA 信號在木薯抗逆和PPD 過程中的功能奠定基礎。【擬解決的關鍵問題】通過對MePYL12 基因進行克隆，對其編碼蛋白序列進行生物信息學分析，分析MePYL12 基因在不同處理和PPD 過程中的表達模式，為研究MePYL12基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所保存并提 供木薯SC124（Manihot esculentacv. SC124）作為試驗材料。RNA 提取和反轉錄試劑分別購自天根生 化（No.: DP437）和Fermentas（No.: K1622）。上海生工合成PCR 引物。

1.2 材料處理

木薯種莖切成15 cm 左右的莖稈小節，每個小節有3～4 個芽點，分別種入盆中生長，盆中土壤比例為蛭石∶營養土=1∶1（V/V）。挑選生長狀況類似的植株（生長約60 d）作為處理材料。PEG-6000（20 %,W/V）澆灌植株來模擬干旱，澆水的植株作為對照，分別在0、3、5、7 d 后收集樣品（取植株的老葉、第一片完全展開葉和未展開葉混合為1 個樣品，共5 個），進行3 次重復。對樣品采用液氮進行速凍后于?80 ℃保存；ABA 溶液噴灑木薯苗子（濃度為100 μmol·L?1），在0、3、5、7 d 分別收集處理后的葉片。葉片樣品液氮處理后置于?80 ℃保存；取生長期約為10 個月的木薯塊根，將塊根切成片狀（厚度為5 mm 左右）后實行暗培養，溫度為25 ℃（RH 70 %），處理相應時間（0、6、12、48 h）后收集塊根樣品（重復3 次），塊根樣品液氮處理后置于?80 ℃。

1.3 基因克隆

葉片cDNA 模板通過反轉錄葉片RNA 獲得。根據Phytozome 數據庫中的木薯同源序列（Manes.02G087400.1）設計引物（P1: 5′-ATGGAACCTAACC AATCCCAG-3′; P2: 5′- GGCTTCTCTGGATGGACAT GAA-3′），以葉片cDNA 為基因模板克隆MePYL12，擴增片段送測序公司驗證。

1.4 生信分析

在數據庫NCBI 中搜索比對同源序列；ExPASy ProtParam 預測MePYL12 的理化性質；蛋白的結構預測使用SWISS-MODEL 和SOPMA 等在線網站[17]；Plantcare 分析啟動子元件組成；NCBI-CDD 預測保守結構域；序列比對采用DNAMAN6；NJ 法構建進化樹；Primer 5.0 進行引物設計。

1.5 基因的表達分析

上海美吉生物技術有限公司完成處理樣品的RNA 提取和建庫，然后通過Illumina GAII（Illumina,San Diego, CA, USA）測序平臺進行測序。測序數據處理方法見參考文獻[24]。FPKM（Fragments per kilobase per million mapped reads）值代表基因表達水平。

2 結果與分析

2.1 克隆MePYL12 基因

擬南芥PYR1-like2 的蛋白質序列（基因登錄號:AT3G24520）作為比對序列，在Phytozome 中比對搜索木薯基因組，得到了相似性較高的序列Manes.16G079500.1。針對Manes.16G079500.1 的核苷酸序列進行引物設計并擴增，最后測序得到全長為567 bp的片段（圖1），氨基酸總數為188 個，將其命名為MePYL12 基因。MePYL12 蛋白預測的分子式為C926H1 466N244O286S6，不穩定指數為35.4，預測為穩定蛋白。MePYL12 蛋白的等電點和分子量分別為5.55和20.8 kD。對MePYL12 蛋白進行二級預測顯示，α-螺旋占40.96%，無規則卷曲占36.17%，延伸鏈占18.09%，β-轉角占4.79%。MePYL12 蛋白的三級結構預測發現，MePYL12 蛋白包含有2 個α-螺旋和7 個β-折疊的典型PYL 螺旋手柄結構（圖2）。同時進行的保守結構預測分析顯示MePYL12 蛋白含有PYR/PYL/RCAR like 家族結構域（圖3），這些預測結果表明克隆得到的基因屬于PYL 家族基因。

圖 1 MePYL12 基因擴增結果Fig. 1 PCR amplification of MePYL12

圖 2 MePYL12 蛋白三級結構預測Fig. 2 Predicted tertiary structure of MePYL12

2.2 MePYL12 基因的進化分析

以MePYL12 基因作為探針，在數據庫NCBI 中進行蛋白序列比對，得到和目標基因氨基酸序列一致性較高的蛋白序列，其中橡膠樹（XP_021640277.1）的序列相似性最高，達到94.68%；其次是蓖麻（XP_002516457.1），達到86.77%。從圖4 可知MePYL12基因的序列和其他PYL 基因的序列具有很高的一致性，特別是蛋白結構中和ABA 結合的區域“Latch”和“Gate”序列100%一致（圖4），能夠證明MePYL12屬于PYL 家族。進一步的遺傳進化分析顯示，MePYL12和RcPYL2、HbPYL2-lke在同一分支，三種植物都屬于大戟科，證明PYL 蛋白的氨基酸序列相似性很高（圖5）。

圖 3 MePYL12 結構域分析Fig. 3 Conserved domain analysis on MePYL12

圖 4 MePYL12 蛋白序列的同源性比對Fig. 4 Homologous sequence alignments of MePYL12

2.3 MePYL12 基因的組織表達分析

從數據庫中（shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）下載得到的表達數據為10 個未經處理的木薯組織。10 個組織分別是分化胚組織（organized embryogenic structure, OES）、莖頂端分生組織（shoot apical meristem, SAM）、根頂端分生組織（root apical meristem, RAM）、須根（fibrous root, FR）、側芽（lateral bud, LB）、葉柄（petiole, P）、莖（stem, S）、中脈（midvein, M）根（storage root, SR）和葉（leaf,L）。結果顯示MePYL12 基因在不同組織中呈現出不同的表達量，較高的表達量則出現在葉片、SAM 和RAM 出現在葉片、SAM和RAM 等組織（圖6）。

2.4 不同處理條件下的MePYL12 基因表達分析

MePYL12 基因含有ABRE 和MBS 等元件（表1）。MePYL12 基因在模擬干旱和ABA 處理下的表達水平被顯著誘導，在處理5 d 后表達量被顯著提高并達到峰值，隨后表達量逐漸下降（圖7），這些結果表明MePYL12 基因明顯受到PEG 和ABA 誘導。

為探究MePYL12 基因和木薯塊根PPD 之間的聯系，對MePYL12 基因在此過程中的表達情況進行分析。如圖8 所示，MePYL12 基因的表達水平在PPD早期（6 h）被顯著誘導并達到峰值，隨后12 h 和48 h的表達量逐漸下降。這些結果表明MePYL12 基因明顯受到PPD 誘導，推測MePYL12 基因在PPD 過程中可能發揮重要作用。

圖 5 PYL 基因的系統進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of PYL genes

圖 6 不同組織中的MePYL12 表達Fig. 6 Expression of MePYL12 in different tissues/organs of cassava

圖 7 MePYL12 基因在不同處理下的表達，A：ABA；B：PEGFig. 7 Expressions of MePYL12 under Treatment A (ABA) and Treatment B (PEG)

表 1 MePYL12 啟動子元件組成分析Table 1 Promoter elements of MePYL12

圖 8 MePYL12 基因在PPD 中的表達變化Fig. 8 Expressions of MePYL12 of cassava tubers in PPD

3 討論與結論

不同物種中的PYL 數量不一樣，作為ABA 信號途徑的核心組件，分析PYL基因的功能，為進一步解析ABA 信號通路有重要作用。本研究克隆得到了木薯MePYL12 基因，MePYL12 蛋白的氨基酸數量為188 個，三級結構預測含有典型PYL 螺旋手柄結構，保守結構預測含有PYR/PYL/RCAR like 家族結構域（圖4），多序列比對顯示ABA 結合的關鍵蛋白序列Latch 和Gate 環100%一致[5]，結果表明MePYL12和蓖麻及橡膠樹的PYL 蛋白的進化關系較近。這些結果都證明MePYL12 基因屬于植物PYL家族。

木薯（Manihot esculentaCrantz）是熱帶重要的經濟作物之一，但木薯塊根收獲后出現的PPD 現象嚴重限制了其在工業中的大規模利用[21?23]，研究表明ABA 信號在采后貯藏方面扮演非常重要的角色，能夠影響果實的存儲品質和采后生理指標[25]。另外，PYL作為ABA 信號途徑中的核心成分，是植物通過ABA信號響應非生物脅迫的關鍵因子。如2019 年報道在小麥中過表達ABA 受體TaPYL4 大幅度提高了植株應對干旱的能力[26]；玉米ZmPYL9 和棉花GhPYL9-11A都可以提高擬南芥在干旱脅迫中的存活能力[9,15]；楊樹PtPYRL1/5 基因的過表達能夠提高植株清除活性氧的能力[14]。擬南芥基因PYL9 的過表達能夠在植株受到干旱脅迫時顯著提高細胞中的抗氧化酶活性來保護細胞[11]。有研究表明活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是木薯塊根PPD 發生的主要因素之一，因此，清除ROS 將能大大延緩PPD 過程的發生[27,28]。而MePYL12 基因在ABA 處理和干旱脅迫中受到誘導，在塊根PPD 過程中也顯著被誘導。因此，推測MePYL12 基因可能參與木薯塊根的PPD 過程，同時具有提高植物應對非生物脅迫的能力，這和之前的研究類似[16,17]。這些結果能為進一步研究MePYL12基因在延緩木薯PPD 過程和提高非生物脅迫中的適應能力提供參考。