鄂北崗地山藥病害病原菌鑒定

楊小林，張佑宏，王佐乾，常向前，呂 亮，張 舒，楊新筍

（1. 糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；2. 湖北省農業科學院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；3. 湖北省生物農藥工程研究中心，湖北 武漢 430064；4. 湖北省農業科學院糧食作物研究所，湖北 武漢 430064）

0 引言

【研究意義】 山藥（Dioscorea batatas Decne），又名大薯、薯蕷，是一種藥食兩用的深根性草質藤本植物[1]，是薯類的一個重要類別。由于山藥具有較高的藥用價值和營養價值[2?3]，鄂北崗地一直有種植山藥的栽培傳統，隨著農村產業結構的調整和山藥種植面積的逐年擴大，山藥已成為當地農村經濟的主導產業。山藥栽培過程中為害地上葉片和莖蔓造成枯葉枯枝的重要病害有炭疽病[4]、褐斑病等，常年因病害減產20%左右，嚴重年份達到80%，給山藥產業造成了極大的損失。由于對山藥主要病害的病原菌欠缺分離和鑒定，致使病害的病原菌不清，因此開展對山藥病害病原菌的分離和鑒定是當務之急。【前人研究進展】 對造成作物炭疽病害的炭疽菌（刺盤孢屬，Colletotrichum）的研究，從最初報道發現至今已有很長的歷史，炭疽菌已成為世界第八重要植物病原真菌[4]。基于形態學特征和分子生物學技術，多國學者在其分類方面取得了顯著的進展[5?6]。王國平團隊[7]通過對我國梨品種中的白梨、砂梨和西洋梨炭疽病樣品的研究，表明果生炭疽菌C. fructicola是我國梨樹炭疽病的優勢流行菌種，研究還發現兩個刺盤孢屬新種C. jinshuiense和C. pyrifoliae。山藥炭疽病是引起山藥地上葉片和藤蔓組織發病的重要病害，國內外關于山藥病原菌的研究表明，山藥炭疽病原菌屬于子囊菌亞門膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz）[8?11]、Gloeosporium Pestis[12]或者辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）[13]。Dean 的研究結果表明，山藥炭疽病病原菌在地理分布上存在差異[10]。 【本研究切入點】 鄂北崗地山藥病害嚴重且病原菌不清，有關鄂北崗地山藥病害病原菌的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】明確鄂北崗地山藥病害病原菌的分類地位，科學認識鄂北崗地山藥病害的病原特性，通過與其他作物上同類病原菌的分類進行比較，從而有效指導科學用地，避免病害相互侵染。

1 材料與方法

1.1 病樣采集和病原菌的獲得

1.1.1 鄂北崗地山藥病害病樣采集 2019 年8 月于鄂北谷城縣調研山藥生產情況，發現山藥病葉，裝袋保存并記錄，帶回實驗室保存備用。

1.1.2 病原菌的分離和純化 采用組織分離法[14]對葉片病樣進行病原物的分離與純化。

1.2 致病性測定

準備接種用的5 mm 菌餅若干。在9 cm 培養皿底部墊上用無菌水浸濕的紙巾，將新鮮健康山藥葉片平鋪于培養皿中保濕，采用人工離體接種方法進行致病性測定，接種方法包括有傷、無傷兩種處理方式[15]。

1.3 病原菌的形態特征觀察

1.3.1 病原菌PDA 菌落觀察 于PDA 平板上25 ℃、12 h /12 h 光暗交替下培養病原菌7 d，觀察菌落的形態特征；用0.05%吐溫20 溶液洗下病原菌孢子，制作玻片在OLYMPUS 1X2-UCB 顯微鏡下觀察病原菌的形態。

1.3.2 病原菌侵入組織觀察 以山藥葉片主葉脈為中心，對稱切取2 塊1 cm2接種后的山藥葉片，參照文獻[16]的方法進行染色并保存備用；制作簡易玻片[14]，于顯微鏡下觀測病原菌的形態特征并拍照。

1.4 病原菌的分子鑒定

采用CTAB 方法[17]提取病原物基因組DNA，進行ITS-PCR 鑒定[18]，通過PCR 產物測序獲得病原真菌ITS 序列，與GenBank 中的序列進行BLAST 比對分析。引物合成和PCR 擴增產物測序分別由上海生工生物工程技術服務有限公司和武漢天一輝遠公司完成。

2 結果與分析

2.1 病原物的形態特征

于鄂北崗地谷城縣春天山藥種植專業合作社田間采得山藥感病葉片，上面清晰可見褐色不規則形狀病斑（圖1）。于實驗室分離獲得真菌分離物，經純化后獲得4 個代表菌株，分別標記為C20FG001～C20FG004（圖2）。在PDA 培養基上，C20FG001 菌落灰色，氣生菌絲發達，表面蓬松，邊緣整齊。該菌在常規培養基上不產生子實體，后在人工接種24 h的山藥葉片上發現有分生孢子，孢子大小約13.77 μm×4.22 μm，呈長筒形，內有核，分成雙孢（圖3-A）。C20FG002 菌落灰白色，短絨狀，緊湊，圓形，邊緣較整齊。菌絲光滑有隔膜，分生孢子大小約20.15 μm×9.83 μm，倒棒狀或紡錘形，頂端有喙狀突出，成熟的分生孢子內有2 至多個分隔，分生孢子可數個成鏈（圖3-B）。C20FG003 菌落色深，近黑色，短絨狀，色均，圓形，邊緣整齊。營養菌絲光滑有隔，分生孢子大小約14.92 μm×4.27 μm，兩端鈍圓，有的中間略有內陷，棍棒形或圓柱狀，內部中間色淺兩端色深，顯示有物質均勻分布（圖3-C）。C20FG004菌落深灰色，緊湊，色均，平展，邊緣整齊。營養菌絲有隔，分生孢子大小約13.11 μm×4.40 μm，兩端鈍圓，多數呈短圓柱狀，少數為紡錘形，孢子內中間色淺兩端色深有物質均勻分布（圖3-D）。

2.2 病原菌的ITS 鑒定

為進一步明確病菌的分類地位，對菌株進行DNA-ITS 鑒定（圖4）。4 段序列的大小介于510～550 bp。比對Genbank 中已登錄的模式序列，發現代表菌株C20FG001 與假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae，登錄號為KY783459.1）的同源相似性達100%， C20FG002 與互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata，登錄號為KX064978.1）的同源相似性達99.63%， C20FG003 與果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola，登錄號為KP748224.1）的同源相似性達99.27%， C20FG004 與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，登錄號為MK967281.1）的同源相似性達96.37%。根據菌落的培養形態、分生孢子的顯微形態及ITS 序列的比對分析，確定鄂北崗地山藥病害的病原菌包括：座囊菌綱（Dothideomycetes）葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）毛色二孢屬（Lasiodiplodia）的假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）、座囊菌綱（Dothideomycetes）格孢腔菌目（Pleosporales）格孢菌科（Pleosporinea）鏈格孢屬（Alternaria）的互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata），以及糞殼菌綱（Sordariomycetes）小叢殼目（Glomerellales）小叢殼科（Glomerellaceae）刺盤孢屬（Colletotrichum）的果生炭疽菌（C. fructicola）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

圖 1 山藥病葉Fig. 1 Diseased leaves on vines of Chinese yam

圖 2 菌落形態Fig. 2 Colony morphology

圖 3 顯微形態Fig. 3 Microstructure

圖 4 菌株基因組DNA-ITSFig. 4 Applied fragment of pathogenic fungi by DNA-ITS

2.3 病原菌的致病性測定

無傷情況下分別接種4 個菌株，山藥葉片上均未出現病斑；有傷情況下（圖5），接種4 個菌株的菌餅，C20FG001 經ITS 鑒定為假可可毛色二孢，接種后葉片于96 h 出現明顯病斑，接種處葉片組織變深褐色，水漬腐爛狀。C20FG002 經鑒定為互隔交鏈孢霉，接種處葉片組織于24 h 感病，病斑邊緣深褐色，中央灰白色，周圍有水浸狀暈圈。C20FG003 和C20FG004 系炭疽菌，接種后山藥葉片組織于48 h 后出現明顯病斑，96 h 后病斑上出現橘色膠質顆粒，表現明顯的炭疽病病狀和病癥。有傷、無傷空白對照無變化。對人工接種24 h 后的山藥葉片進行染色、脫色處理，顯微鏡檢顯示接種C20FG002、C20FG003和C20FG004 的葉片出現大量分生孢子，孢子外形同圖3；C20FG001 在培養基上沒有檢測到子實體，接種24 h 后通過染色、鏡檢發現葉片上出現成片的分生孢子（圖3-A）。分別回收病樣并作病菌分離和純化，獲得菌株的培養性狀與接種菌株一致，因此確定 代 表 菌 株C20FG001、C20FG002、C20FG003 和C20FG004 是引起谷城縣春天山藥合作社基地山藥葉片及莖蔓發生枯萎和死亡的病原真菌。

圖 5 山藥葉片接種菌株后的發病情況Fig. 5 Symptoms on leaves of Chinese yam plants after artificial fungal inoculation

3 討論與結論

本研究在山藥感病葉片上分離獲得11 個菌株，經培養、顯微觀察、ITS 鑒定及序列比對，選擇出代表菌株4 株，分別為假可可毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae、互隔交鏈孢霉Alternaria alternata、果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。經致病性測定，確定這4 個代表菌株均是引起山藥健康葉片感病的致病病原菌。

假可可毛色二孢是農、林業的重要植物致病菌，其寄主范圍廣泛，可侵染寄主植物的枝干和果實，王佳寧等[19]報道假可可毛色二孢是引起山東青島膠南藍莓枝枯病的致病真菌，該研究也是對假可可毛色二孢侵染藍莓的首次報道。本研究從鄂北崗地山藥枯死的病組織中分離、鑒定出假可可毛色二孢，在以往的國內外研究中均未見報道假可可毛色二孢可侵染山藥。

鏈格孢是農作物上的重要致病菌，至今已報道的有500 多種，能引起寄主作物落花落果和枯梢等，造成的病害包括重要經濟作物，如柑橘鏈格孢褐斑病（Alternaria brown spot, ABS）[20?21]、新疆紅棗縮果病和棗果黑斑病[22]，可導致嚴重的經濟損失。本研究分離獲得的互隔交鏈孢霉，會造成山藥葉片和莖蔓出現病斑甚至枯死，是否會引起山藥塊莖產生病害，還需進一步的研究。

本研究中分離獲得的膠孢炭疽菌是狹義的膠孢炭疽菌C. gloeosporioides和分離獲得的果生炭疽菌C. fructicola同屬廣義的膠孢炭疽病復合群C.gloeosporioides，該群最初包括13 個合格種、10 個新種、1 個變種[23]，之后不斷有新種添加進膠孢炭疽菌復合群中[24]。依據形態學特征和ITS 序列鑒定出的炭疽病菌屬于刺盤孢屬Colletotrichum中的重要分支——膠孢炭疽病復合群C. gloeosporioides，表明鄂北崗地山藥炭疽病系由復合群內多個分類單位的真菌引起的，其精細分類地位尚需在后續研究中進行多基因與ApMat 系統發育分析。已報道的鄂西地區山藥炭疽病病原為膠孢刺盤孢（C.gloeosporiodes）[4]，其與本研究鑒定出的膠孢刺盤孢（C.gloeosporiodes）是否屬于同一種下分類單位，還需作進一步的采樣與鑒定研究。

刺盤孢（Colletotrichum）中重要的分支菌群膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）不僅能侵染山藥，而且能夠侵染茶葉[25]、茶源植物多穗柯[26]、辣椒[27]、大豆[28]、草莓[29]、菠蘿蜜[30]等，嚴重影響作物的健康生長，降低其產量和品質。王薇[31]通過對蘋果炭疽葉枯病的研究，鑒定出其病原菌為膠孢刺盤孢復合群下的3 個種：果生刺盤孢C. fructicola、隱秘刺盤孢C. aenigma和嘎拉刺盤孢C. galae，同時對蘋果園周邊的辣椒、獼猴桃、葡萄等寄主作物的炭疽病標樣進行分析測定，研究結果表明：來自蘋果園周邊寄主的炭疽菌可以作為蘋果炭疽病的侵染源。鄂北崗地山藥生產基地炭疽病菌的來源及周邊農作物是否相互感病尚待進一步深入研究。

本研究在形態學鑒定的基礎上，結合現代分子生物學方法對病害的病原菌進行了系統鑒定和分析，結果顯示：鄂北崗地大田山藥的生長環境復雜，有多病害發生，厘清病原菌的組成及分類地位，對于病害的預防和防治，尤其是對于通過綠色防控措施降低大田環境中的重要病害菌源、減少重要病害造成的經濟損失，以及保障山藥產業的健康發展均具有積極意義。

致謝：感謝湖北省農業科學院薛敏峰博士在測序結果分析中給予的熱心幫助！